Полиморфизм генов гемостаза у мужчин и женщин с бесплодием

Обследованы супружеские пары и женщины с диагнозом «бесплодие». Определены частоты частоты аллелей и генотипов в трех генах фолатного обмена (MTHFR C667T, MTR А2756G, MTRR A122G) и протромбина (FII A20210G). У мужчин отмечается увеличение частоты полиморфных аллелей MTHFR 667T и MTR 2756C, а также генотипов, содержащих эти аллели и их сочетания. Наличие в генотипе сочетаний  низкофункциональных аллелей MTHFR 667T+ MTR 2756C, MTHFR 667T + MTRR A66G , MTR 2756C + MTRR A66G генов фолатного обмена и FII 20210G ассоциированы с нарушением репродуктивности и имеет клинические проявления в нарушении гемостаза у мужчин и женщин.

Ключевые слова: бесплодие, MTHFR, MTR, MTRR, FII, гемостаз.

Married couples and women with the diagnosis "fruitlessness" are surveyed. Frequencies of frequency alleles and genotypes in three genes folate an exchange (MTHFR C667T, MTR А2756G, MTRR A122G) and coagulation factor II (thrombin) (FII A20210G) are defined. At men the increase in frequency polymorphic alleles MTHFR 667T and MTR 2756C, and the genotypes, containing these alleles and their combinations is marked. Presence in a genotype of combinations small functional alleles MTHFR 667T + MTR 2756C, MTHFR 667T + MTRR A66G, MTR 2756C + MTRR A66G genes folates an exchange and FII 20210G is associated with infringement fertility also has clinical displays in homeostasis infringement.

Keywords: bareness, MTHFR, MTR, MTRR, FII, a homeostasis.

Введение

В настоящее время одной из значительных проблем в медицине является нарушение мужской и женской фертильности. Бесплодие встречается у пятой части супружеских пар, а привычное невынашивание беременности (ПНБ) составляет 20% от общего числа беременностей. При этом около трети случаев бесплодия не поддаются лечению, так как невозможно установить истинные причины нарушения [2].

Большое влияние на нормальное развитие репродуктивной функции мужчин и женщин, способность к оплодотворению и правильное развитие беременности оказывает ряд генов, относящихся к фолатному обмену (MTR, MTRR, MTHFR), системе свертываемости крови (FII) [3].

Известно, что гены фолатного обмена участвуют в синтезе фолиевой кислоты, которая стимулирует созревание эритроцитов. Уровень фолатов в эритроцитах является наиболее информативным показателем дефицита фолатов [12].

При нарушениях метаболизма гомоцистеина вследствие генетических дефектов ферментов фолатного обмена гомоцистеин накапливается внутри клеток в повышенных количествах, что оказывает цитотоксический эффект на клетку. Это может приводить к спонтанным абортам,  венозной тромбоэмболии [1].

Гены системы свертываемости крови, влияют на свертываемость крови и склонность к тромбообразованию. В тромбоцитах содержится 12 факторов свертывания крови. В условиях генетически обусловленного гипофибринолиза, активации внутрисосудистого свертывания крови происходит десинхронизация процессов фибринолиза и фибринообразования при имплантации,[5].

Эозинофильные гранулоциты провоцируют дегрануляцию базофильных гранулоцитов и в активном состоянии вырабатывают лейкотриены. Некоторые из катионных белков эозинофилов связываются с гепарином и снижают его антикоагулянтную активность, что может привести к увеличению свертываемости крови, и, как следствие, тромбообразованию. Появление тромбов в кровотоке матки может препятствовать кровоснабжению плода, что, в свою очередь, может привести к ПНБ [6],[7].

Материалы и методы исследования

В исследование включены 56 пациентов областного центра планирования семьи, женских консультаций, (женщин- 41 , мужчин- 15) в возрасте от 20 до 45 лет, проживающих в Ростове-на-Дону. Среди них было 12 супружеских пар с диагнозом бесплодие и 16 женщин с нарушением фертильной функции (в анамнезе привычное невынашивание беременности, бесплодие I или II степени). В контрольную группу включены 3 фертильные супружеские пары (имеющие как минимум одного родного ребенка) и 10 женщин без репродуктивных проблем.

Материалом для исследования служила венозная кровь, забранная Vacuette с ЭДТА из локтевой вены утром натощак в количестве 3 мл. Выделение ДНК и последующие молекулярно-генетические исследования проводились методом полимеразно-цепной реакции. Для выделения ДНК из лимфоцитов периферической крови использовали коммерческий набор реагентов DIAtom™ DNA Prep 100. Исследование полиморфизма 677 C->T (A223V) гена метилентетрагидрофолат-редуктазы (MTHFR), D919G A->G гена метионинсинтазы (MTR), I22M A->G гена метионинсинтазы-редуктазы (MTRR), 20210 G->A гена протромбина (F2) из полученной ДНК проводили с использованием набора реагентов SNP-экспpecc (Литех, Москва).

Разделение продуктов амплификации проводили методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. Анализ электрофореграмм проводили под УФ на трансиллюминаторе BioRad.

Выполняли общий анализ крови с подсчетом числа эритроцитов, гемоглобина. Полуавтоматическим методом на спектрофотометре SmartSpec (BioRad), лейкоцитов в счетной камере Горяева, унифицированным микрометодом определения СОЭ. Фиксированные препараты крови готовили при помощи красителей: эозин-метиленовый синий по Май-Грюнвальду (в растворе) и азур-эозина по Романовскому (ЭКОлаб), бриллиантового крезилового синего (ЭКОлаб). Цитологическое исследование морфологии форменных элементов и подсчет лейкоцитарной формулы крови проводили на лабораторном микроскопе Axioskor 40/ Axioskor 40 FL (Carl Zeiss).

Статистическую обработку полученных данных с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0. Работу проводили на базе НИИ Биологии ЮФУ и КДЛ «Наука».

Результаты и обсуждение.

В группе  мужчин с нарушением репродуктивной функции отмечается статистически значимое увеличение в 2 раза частоты полиморфного  аллеля 667Т в гене MTHFR (метилентетрагидрофолат-редуктазы)  и 2756G в гене MTR. Генотип 122M (G/G и А/G) в гене MTRR был более частым в контрольной группе, у мужчин из группы бесплодных пар он встречался значительно реже. Отсутствие достоверного уровня значимости возможно за счет малого размера выборки. Полиморфный аллель 20210 G/A фактора свертываемости II (FII) у мужчин с нарушение репродуктивной функции  вообще не встретился, тогда, как в контрольной группе его частота составила 2%.

У женщин с нарушением фертильности отмечается статистически значимое уменьшение доли генотипа  667Т/Т в гене MTHFR, а также генотипов, содержащих аллель A2756G в гене MTR. Генотипы, содержащие полиморфные аллели G в позиции 122 гена  MTRR у женщин с нарушением функции репродукции были более редкими по сравнению с фертильными женщинами. Отсутствие достоверных различий, по-видимому, связано с размерами изучаемых групп. У женщин с бесплодием отмечается увеличение доли генотипа 20210 А/G в гене протромбина (FII). Статистически значимых отклонений частот генотипов, содержащих аллель 667Т в гетерозиготном состоянии гена MTHFR у фертильных женщин и у женщин с нарушением репродуктивности, выявлено не было, по-видимому,  за счет размеров исследуемой выборки.

Полученные тенденции, в целом подтверждают результаты многих работ [8],[11] в пользу влияния полиморфизмов генов фолатного обмена (MTHFR, МТR, MTRR) и протромбина (FII) на развитие не только привычного невынашивания беременности, но и бесплодия. Примечательно, что в 96% случаев пациентов с бесплодием встречаются сочетания  полиморфных аллелей исследуемых генов фолатного обмена и протромбина. Изучаемые гены задействованы в одном каскаде, и поэтому высоковероятно наличие межгенных взаимодействий генов этих белков [13].

Так, в нашем исследовании у 4% женщин, 8% мужчин и 16% супружеских пар было выявлено  статистически значимое гомозиготное носительство полиморфных аллелей A2756G гена MTR и Т667Т MTHFR одновременно. В контрольной группе такое распределение генотипов выявлено не было.                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                  

            В группе мужчин около 30% пациентов имели такое распределение генотипов, при котором имелось гетерозиготное носительство полиморфного аллеля Т667 MTHFR и гомозиготное носительство нормальных аллелей гена 122А MTRR. Такое же распределение генотипов было выявлено у 25 %. Приблизительно треть супружеских пар (34%) и 12% женщин имели распределение аллелей, при котором пациент имел гомозиготное носительство полиморфной аллели 667Т гена MTRR, был гетерозиготой по гену MTHFR и являлся гомозиготой с нормальными аллелями A2756по гену MTR. В контрольной группе этот показатель составляет всего 7%.

            Так же было установлено, что 50% супружеских пар (хотя бы у 1 из супругов) и 33% мужчин имели гетерозиготное носительство гена MTHFR и при этом являлись гомозиготами с нормальными аллелями по генам A2756 MTR и А122 MTRR. В контроле этот показатель составил 11%.

            Сочетанный анализ показал, что у 50% супружеских пар с бесплодием имеется хотя бы у одного из супругов гомозиготная мутация одного из генов фолатного обмена. У группы мужчин этот показатель составил 30%, а у  женщин – 25%.    Однако, у 80% женщин и мужчин имеется гетерозиготное носительство хотя бы одного полиморфного аллеля одного из генов фолатного обмена. В группе супружеских пар такое носительство полиморфных аллелей хотя бы у одного из супругов было встречено в 100% пар.

Известно, что дефекты генов фолатного обмена проявляются в организме,   прежде всего накоплением гомоцистеина [10].  Гомоцистеин обладает выраженным токсическим свойством, при этом негативные воздействия, оказываемые им, очень разнообразны. Так, у мужчин и женщин  с нарушением фертильности в 64% случаев полиморфизм генов фолатного обмена ассоциирован с количеством  широкоплазменных лимфоцитов,  превышающих допустимое  значение (10%). У мужчин и женщин с полиморфизмом генов гемостаза (MTHFR, МТR, MTRR и FII) отмечается повышенное содержание эозинофилов.

Показано, что в более чем в половине случаев причиной тромбозов является тромбофилия, т.е. нарушение гемостаза, обусловливающие склонность к развитию тромбозов кровеносных сосудов  различного калибра и локализации [9]. Достаточно хорошо изучены механизмы развития тромбоза при дефиците  естественных антикоагулянтов при мутации в гене фактора V(Leiden) и  20210G/A в гене протромбина (F П) [12].

В последние годы отмечен значительный рост числа исследований, посвященных гипергомоцистеинемии (ГГЦ) как одной из причин, обусловливающих развитие тромбофилии. Гомоцистеин вызывает повреждение эндотелиальной выстилки сосудов и запускает процессы коагуляции. Возможно и по этой причине, у пациентов с генотипом (МТHFR С/Т, Т/Т + MTRR G/G) в 70 % случаев отмечается тромбоцитоз. В формуле тромбоцитов преобладают юные формы. У трети из них в крови отмечается анемия  в анамнезе и в настоящее время, подтвержденная снижением гемоглобина.

В фиксированных мазках периферической крови определяются гипохромные эритроциты, с наличием анизоцитоза. Витамины В₁₂ и фолиевая кислота принимает участие в синтезе ДНК и РНК и, в частности, клеток эритроцита. Поэтому при его дефиците  нарушается структура эритроцитов. Замедляется процесс созревания и дифференцировки клеток в костном мозге [3].

Статистически достоверных различий с показателями фертильных мужчин и женщин нет, по-видимому  за счет малого размера исследуемой выборки, при ее увеличении  тенденции будут иметь статистически значимые значения.

Таким образом, выявленные различия в частотах полиморфных аллелей в изучаемых группах согласуются с  данными литературы о важной роли фолатного обмена, в частности  полиморфизмов MTHFR С677Т  и MTRR A122G  в патогенезе нарушения фертильности. Полиморфизм генов фолатного обмена  и протромбина ассоциирован с повышением  уровня тромбоцитов, эозинофилов и широкоплазменных лимфоцитов в периферической крови.

Исследование выполнено при поддержке Carl Zeiss в рамках «Программы поддержки научно-исследовательской работы молодых ученых России».

Литература:

1. Луговская С.А., Почтарь М.Е. Гематологический атлас / -М., 2004, -С 234-235.
2. Реутова Н.Н., Лемешко А.А., Цапко Л.П. Частота наследственных тромбофилий у пациенток с привычной потерей беременности в ранних сроках //Материалы IV съезда акушеров-гинекологов России.: Тез. докл.  – М., 2008. -С.219.
3. Бескоровайная Т.С. Влияние некоторых генетических факторов на нарушение  ре-продукции у человека: Дис…канд. мед. наук. - М., 2005. - 89 с
4. Козинец Г.И. Атлас клеток крови и костного мозга: Учебное пособие. - М., Изд-во «Триада-Х»., 1998, -С75-90
5. Макацария А.Д., Бицадзе В.О., Акиньшина С.В. Тромбозы и тромбоэмболии в акушерско-гинекологической клинике. Молекулярно-генетические механизмы и стратегия профилактики тромбоэмболических осложнений //Материалы VI российского форума «Мать и дитя».:  Тез. Докл. -М., 2007. - Т.1. - С. 9.
6. Юшканцева С.И., Быков В.Л. Гистология, цитология и эмбриология. Краткий курс: Учебное пособие.- СПб.: Издательство «П-2», 2006, -С 96.
7. Кузнецов С.Л., Мушкамбаров Н.Н., Горячкина В.Л. Атлас по гистологии, цитологии и эмбриологии: Учебное пособие, — М.: Медицинское информационное агентство, 2002.

—    С. 45-55.

8. Hobbs C.A., Sherman S.L. Polymorphisms in Genes Involved in Folate Metabolism as Maternal Risk Factors for Down Syndrome // Am J Hum Genet. - 2000. - V. 67. - Р. 623-630.
9. Блинов М.Н., Капустин С.И., Кобилянская В.А., Папаян Л.П. Молекулярная диагностика тромбофилий.В кН.:Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза/Под ред. ЗС. Баркагана и А.П. Момота .- М.:Ньюдиамед, 2001.- С.296
10. Жлоба А.А. Лабораторная диагностика при гипергомоцистеинемии //Клинико-лабораторный консилиум.. 2009. №1(26).- С.49-60.
11. Жлоба А.А. Лабораторная диагностика при гипергомоцистеинемии //Клинико-лабораторный консилиум. Лекция 2. Часть 2 2009. №2(27) –С.64-71.
12. Шмелева В.М., Капустин С.И., Блинов М.Н., Папаян Л.П. Гипергомоцистеинемия-значимый предиктор развития и неблагоприятного клинического течения венозных тромбозов.// Клинико-лабораторный консилиум.. 2009. №1(26).- С.61-68.
13. Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. М.: Триада-Ч. 2002.39, 46, 70, 102.