Опосредование серотонинергической системой влияния неблагоприятных факторов на перекисное окисление липидов в тканях животных

 The study concerns analysis of involvement of serotonergic system in cor­rection of adverse impact of sediments contaminated with industrial wastes, on the level of lipid peroxidation (LPO). The studies are con­ducted on the sturgeon juve­niles (Acipenser gueldenstaedti persicus). In the first series of studies twice intramuscular administration of serotonin-modulating anticonsolidation protein (SMAP) to sturgeon juveniles being in linear relationship with serotonin level, leads to noticeable normalization of LPO level in animal tissues, whose upregu­lation is due to keeping sturgeons in the fresh water contaminated with sediments. In the second series of studies administration of anti-SMAP polyclonal antibodies to animals induces significant elevation of LPO level in the tissues similar to the effects of sediments. The conclusion that adverse factors can realize their negative prooxidative effects on organism’s tissues through downregulation of serotonergic system, whereas artificial upregulation of serotonergic system pro­motes correction of oxidative stress is put forward.  

Key words: lipids peroxidation, sediments, serotonin-modulating anticonsolida­tion protein (SMAP), anti-SMAP polyclonal antibodies.

Как показали исследования, акти­вация перекисного окисления липидов (ПОЛ) в тканях живых организмов, являющаяся свобод­но-радикальным про­­­­­­­­­­цессом расщепления по­ли­ненасыщенных жирных ки­с­лот, про­ис­ходит вслед­ствие воз­дей­ст­вия стрессорных факторов окру­жающей среды: крайних значений темпе­ра­­ту­­ры, све­та или воздействия ксенобиотиков [1]. Повы­шен­ные кон­цен­трации малонового ди­альдегида (МДА), про­дукта расщеп­ления ли­пид­ных эн­до­­пе­рекисей, а также гидроперекисей (ГП) являются показате­лями уров­ня ПОЛ [2].

В ранее проведенных исследованиях в коре головного мозга крыс был иденти­фицирован и из целого мозга выделен новый серотонин-модули­руе­мый антиконсолида­ционный белок (СМАБ) [3]. Биохи­мическими исследо­вани­я­ми, выполнен­ны­ми на коре голо­в­но­го мозга нарко­ти­зированных крыс [3, 4], и эл­ек­тро­фи­зио­ло­ги­чес­кими ис­сле­дова­ни­ями, связанными с регистра­цией нейрональной ак­тив­ности на иден­ти­­фи­ци­рованных команд­ных нейро­нах моллю­сков [5], было продемонстрировано, что со­дер­жа­ние СМАБ в нер­вных клетках жи­вот­ных нахо­дится в пря­мой зави­симости от уровня серо­тонина. Данный белок состоит из двух субъединиц с моле­кулярными мас­са­ми 60 и 126 кДа, лишён видовой и тканевой специфи­ч­ности и при внутри­мозговом вве­дении вызывает нарушение консолидации следов памяти у крыс [3, 6]. Бы­ло обна­ружено, что при экспозиции се­ре­бряных кара­сей в загряз­нён­­­ной неф­тью (мес­то­рождение «Чираг» в Каспийском море) воде (100 мг/л) в тече­ние 5 сут наблю­дается значи­тельное повы­шение уров­ня данного белка в пе­че­ни животных при отсутствии мутагенных изменений в клетках, тогда как у быч­ков, отлов­ленных в при­брежных зонах Каспий­с­кого моря, загряз­нён­ных про­мыш­лен­ны­ми отходами, уровень СМАБ в пече­ни резко снижался, сопро­вож­да­ясь выраженными мута­ген­ными изме­не­ниями [7]. Таким обра­зом, по­лу­­­ченные результаты указы­вают на уча­стие СМАБ в реа­лизации защитных механизмов организма. Целью дан­ной работы яв­ля­­лось изуче­ние вли­я­ния при­месей нефти и донных отложений на уро­вень ПОЛ в тканях рыб и воз­можности его кор­рекции путём повы­шения актив­но­сти серотонин­ерги­чес­кой системы вве­дением СМАБ, а также изучение влия­ния инактивации СМАБ анти­телами на уро­вень ПОЛ.

Методы исследования

Поскольку ранее было обнаружено, что СМАБ лишён видовой специ­фич­­­ности [6], в данных исследованиях его выделение осуществляли из мозга быка с применением ранее описанных метолов [3]. Гомогенность белка оце­ни­вали методом электрофореза в полиак­рил­амидном геле в трис-глициновой буферной систе­ме (рН 8,3). Выделенный СМАБ хранили при температуре -20°С.

Опыты проводили на молоди осетров (Acipenser gueldenstaedti persicus) весом 25-30 г. В первой серии исследований были сформированы 3 группы животных: 1) интактные живот­ные (n=7); 2) 1-ая опытная группа (n=7), жи­вотных кото­рой поме­ща­ли на 3 сут в прес­ную воду, содержавшую донные отложения из Бакинской бухты в кон­цен­трации 0,8 ppt; 3) 2-ая опытная груп­па (n=7) – жи­вотным предва­рительно вну­три­мышечно вво­ди­ли СМАБ в объёме 1 мл и концен­тра­ции 1,5 мг/мл, в физио­логическом растворе перед помещением на 3 сут в пресную воду, содер­жав­шую донные отло­жения из Бакинской бухты в кон­центрации 0,8 ppt, по­сле че­го им вновь инъ­ецировали СМАБ и переводили в чистую воду (7 сут). По за­вер­­ше­нии экс­пе­риментов живот­ных умерщвляли и из­вле­кали жабры и го­ловной мозг и опре­деляли уро­­вень мало­но­вого диаль­де­гида (МДА) и гид­ро­пе­рекисей (ГП) по методу Асакава и Матсушита [8]. Опре­­деление концен­трации белка в экс­трак­тах осу­­ществляли по ме­то­ду Бред­форд с приме­не­нием 0,01%-ного рас­тво­ра ку­мас­­си ярко синего G-250 [9] и относили зна­че­ния МДА и ГП к 1 мг белка. Полученные резуль­таты усред­няли по группам и сравнивали по t-кри­терию Стьюдента. Концен­трацию СМАБ перед введе­нием животным доводили до зна­чения 1,5 мг/мл методом Бредфорд.

Анализ состава донных отложений Бакинской бухты с целью опреде­ле­ния элементного состава и присутствия нефтепродуктов осуществляли мето­дом атомно-абсорбционной спектроскопии.

Во второй серии исследований было сформировано 3 группы животных: 1) интактные животные (n=11); 2) животные (n=10), которым вводили кро­личьи неим­мун­ные γ-гло­булины (в целях контроля неспецифических эффек­тов антител, поскольку ан­титела были выработаны у животных другого вида); 3) жи­вот­ные (n=9), которым вводили кроличьи поликлональные анти­тела к белку СМАБ. Препараты вводили внутримышечно в 1-ые и во 2-ые сутки в концентрации 1,5 мг/мл и объёме 0,7 мл, в физиологическом растворе и через 48 ч пос­ле последнего введения (т.е. через 3 сут после первого) животных умер­щ­вляли и извлекали головной мозг и печень для определения уровня МДА и ГП. Кон­центрацию неиммунных γ-гло­булинов и антител доводили до указанного зна­че­ния методом Бредфорд.

Результаты и обсуждение

В результате проведенной первой се­­­рии исследований было ис­­следовано влияние экспозиции молоди осетров в пресной воде, содер­жав­шей донные отложения, на уровень ПОЛ в тканях животных. Анализ состава донных от­ло­жений, собранных со дна Бакинской бухты, выявил следующую кар­тину: нефте­про­дукты – 38,87 мг/г сухого вещества; цинк – 1962 мкг/г; медь – 78,6 мкг/г; никель – 13,3 мкг/г; свинец – 388,7 мкг/г; марганец – 166,5 мкг/г; кад­мий – 0,39 мкг/г; серебро – 17,1 мкг/г; кобальт – 6,8 мкг/г; железо – 13291 мкг/г. Было выявлено, что экспозиция животных в ука­занных условиях при­водила к значи­тельным отклонениям уровня ПОЛ под влиянием донных от­ло­­же­ний. В част­но­сти, в 1-ой опытной группе в жабрах отмечалось двукрат­ное уве­ли­чение уро­в­ня МДА (p<0,01), который под влиянием предвари­тельно вве­дённого СМАБ заметно снижался во 2-ой опыт­ной группе (p<0,05 отно­сительно 1-ой опытной группы), приближаясь к контрольным значениям (Рис. 1). В 1-ой опытной группе также отме­ча­лось резкое увеличение уровня ГП (p<0,001).

При исследовании уровня ПОЛ в головном мозге в 1-ой опыт­ной груп­пе наблюдалось более чем двукратное увеличение уровня ГП под воз­дей­ствием донных отложений (p<0,001), кото­рое также значительно сни­жа­лось во 2-ой опытной группе (p<0,05 отно­сительно 1-ой опытной группы) под влиянием СМАБ (Рис. 2). В пробах головного мозга в 1-ой опытной груп­пе также было выяв­лено заметное увеличение уровня МДА (p<0,01) по срав­не­нию с конт­ролем. Таким образом, под влиянием СМАБ отмечалась коррекция уровня ПОЛ в тканях рыб, нарушенного в результате экспозиции животных в воде, загрязнённой донными отложениями.

В серии опытов с использованием поликлональных антител к белку СМАБ было продемонстрировано, что блокада активности белка СМАБ при­во­дит к изменению уровня ПОЛ в тканях. В частности, вве­де­ние антител вызы­вало значительное (на 78,5%) увеличение уровня МДА в печени жи­вот­ных отно­сительно значений животных, которым вводили неим­мунные γ-глобулины (p<0,01; Рис. 3).

В головном мозге молоди осетров после введения антител была выяв­лена несколько иная картина изменений. В частности, было зафик­сиро­вано резкое (в 3,2 раза) снижение уровня МДА относительно значений группы не­им­мунных γ-глобулинов (p<0,001; Рис. 4). В то же время уровень ГП зна­чи­тельно увели­чился относительно группы неиммунных γ-глобулинов (p< 0,01; Рис. 4).  

Полученные результаты свидетельствуют о значительном изменении уро­­в­­­ня ПОЛ в виде повышения значений МДА и ГП в тканях мо­лоди осетров под воздействием донных отложений Бакинской бухты, извлечённых из учас­тков сброса промышленных отходов.

Результаты ранее проведенных нами ис­­следований позволили предположить, что серотонинергическая сис­тема ор­­­ганизма задействована в обеспечении анти­­мута­ген­ной защиты орга­низма от неблагоприятных условий окру­жаю­щей среды, тогда как истощение её ресурсов приводит к выраженным мута­генным изменениям в тканях [7]. Кроме того, введение СМАБ в организм молоди осетров, помещённых в загрязнённую донными отложениями воду, в значительной степени снижало уровень мутаций [10]. Поскольку ПОЛ считается одним из инди­каторов вли­яния небла­го­приятных факторов окружающей среды на живые организмы [11], восстановление уровня ПОЛ у животных, под­вер­­г­нутых воздействию за­грязнённых донных отло­же­ний, под влиянием СМАБ, ука­зы­вает на непо­сред­­ственное участие серото­нинергической сис­темы в реализации защитных механизмов, способных нивелировать эффекты неблагоприятных факторов на организм.

Результаты экспериментов, в которых изучалось влияние блокады актив­ности СМАБ антителами на уровень ПОЛ, продемонстрировали повышение уровня ПОЛ в печени молоди осетров, аналогичное его повышению, наб­лю­давшемуся после экс­позиции животных в загрязнённой донными отло­же­ни­ями воде. Эти данные позволяют полагать, что неблагоприятные факторы осу­­­ществляют своё негативное воздействие на ткани организма посредством изменения активности серотонинергической системы.

Следует отметить, что внутримышечное введение антител к СМАБ жи­вотн­ым при­вело к неоднозначным изменениям уровня ПОЛ в го­ловном мозге относительно группы животных, получавших инъекции неим­мун­ных γ-гло­бу­­ли­нов: если уровень ГП под влиянием антител возрос, анало­гично эффекту дон­ных отложений, то уровень МДА, напро­тив, резко сни­зился. Сни­­жение уро­в­ня МДА в головном мозге под влиянием антител к СМАБ относительно груп­пы неиммунных γ-глобу­ли­нов имело сходство с эффектами самого СМАБ, описанными выше, и может быть следствием высо­кой скорости обме­на СМАБ в нервных клетках. По этой причине в течение 3 сут после блокады активности СМАБ антителами могло произойти компенсаторное усиление синтеза СМАБ и наблюдаемое снижение МДА, возможно, является след­ст­вием эффектов возросшего уровня самого СМАБ, а не его блокады.    

Как показали наши ранее про­веденные иссле­дования, под влиянием экспозиции серебряных карасей в загрязнённой неф­тью воде в го­лов­ном мозге животных наряду с повышением уровня СМАБ, отражающим соответ­ствующее повышение активности серо­то­нинер­гической системы, также от­ме­­­чается усиление синтеза белковой фракции, предположительно относя­щей­ся к белкам теплового шока - БТШ70 [10]. по­лучен­ные в дан­ной работе антиоксидантные эффекты СМАБ, на наш взгляд, обус­ловлены индукцией синтеза БТШ70, по-види­­мо­му, находящегося под регуля­торным влиянием серо­то­нинергической систе­мы и обеспе­чива­ю­щего протек­тивное действие по отношению к клеточным элементам орга­низ­ма от воздей­ствия неблагопри­ятных факторов окружа­ю­щей среды [12].

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об изменении уровня ПОЛ в форме МДА и ГП в тканях животных, подвергнутых  воздей­с­твию донных отложений, содержащих промыш­лен­ные отходы. Кроме того, сходство эф­фек­тов антител к СМАБ с воздействием донных отложений на уровень ПОЛ даёт основа­ние полагать, что неблагоприятные факторы могут оказывать своё негативное прооксидантное воз­дей­ствие на ткани организма посредством снижения ак­тивности серотонин­ергической системы, тогда как искусственное повы­шение уровня ак­тив­ности серотонинергической системы организ­ма способствует коррекции оксидативного стресса.

Литература

1.      Halliwell B., Gutteridge J.M.C.. Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford: Clarendon Press, 1985, 346 p.

2.      Pompella A., Maellaro E., Casini A.F., Ferrali M., Ciccoli L., Comporti M. Measurement of lipid peroxidation in vivo: A comparison of different procedures.// Lipids, 1987, V. 22, № 1, pp. 206-211.

3.      Мехтиев А.А. Обнаружение в головном мозге крыс белка, обладающего антиконсолидационными свойствами.// Бюллетень экспер. биол. мед., 2000, т.129, №8, с. 147-150.

4.      Гасанов Г.Г., Мехтиев А.А. Выявление серотонин-модулируемой бел­ковой фракции и изучение её участия в организации поведения пассивного избегания // Бюллетень экспер. био­л. мед., 1991, т. 112, № 7, с. 5-7.

5.      Мехтиев А.А., Козырев С.А., Никитин В.П., Шерстнёв В.В. Изби­ра­тельное влияние антител к белку SMP-69 на активность коман­дных нейронов оборонительного поведения виноградных ули­­ток // Российский физиол. журнал им. И.М.Сеченова, 2003, т. 89, № 4, с. 389-396.  

6.      Мехтиев А.А., Асадов Б.М., Мехтиева Л.М. Изменение содержания серо­тонин-модулируемого белка SMP-69 в тромбоцитах больных шизо­фре­нией.// Бюллетень экспер. биол. мед., 2000, т.129, № 2, с. 156-158.

7.      Мехтиев А.А., Гайсина А.А., Палатников Г.М., Касимов Р.Ю. Снижение активности серотонинергической системы в процессах мутагенеза.// Бюллетень экспер. биол. мед.,  2006, т. 142, № 12, с. 611-613.

8.      Asakawa T., Matsushita S. Coloring condition of TBA test for detecting lipid hydroperoxides.// Lipids, 1980, V. 15, № 3, pp. 137-140.

9.      Скоупс Р. Методы очистки белков. Москва: Мир, 1985, с. 173-178.

10.   Мехтиев А.А., Мовсум-заде С.К. Антиму­та­генная активность серотонин­ергической системы и подлежащие механизмы у молоди осетров (Acipen­ser gueldenstaedti persicus) и серебряных карасей (Carassius auratus).// Журнал эволюц. биохимии и физиологии. 2008, т. 44, № 5, c.476-481.

11.  Thomas P. Molecular and biochemical responses of fish to stresses and their potential use in environmental monitoring.// Biological Indicators of Stress in Fish [S.M.Adams, Ed.]. Bethesda: American Fisheries Society, 1990, pp. 9-28.

12.   Sharp F.R., Massa S.M., Swanson R.A. Heat-shock protein protection.//Trends Neurosci., 1999, V. 22, № 3, pp. 97-99.