Актуальность проблемы. Для полноценного лечения перинатальных повреждений центральной нервной системы необходимо понять не только механизмы возникновения гипоксических повреждений мозга, но и его компенсаторные возможности, обеспечивающие устойчивость к действию неблагоприятных факторов [1,2]. Распространенность поражения и его интенсивность непосредственно зависят от мощности защитных механизмов, включающих в себя и антиокислительную систему (АОС). От содержания токоферола, глутатиона, активности глутатионредуктазы, СОД и каталазы зависит характер и объем потерь при ишемии головного мозга [3], а, следовательно, исход его перинатальных повреждений [4].
Известно, что при гипоксии/реперфузии в клетках головного мозга происходит переключение на анаэробный метаболизм, дефицит АТФ, нарушение работы ионных насосов, деполяризация мембран нейронов, высвобождение эксайтотоксичных аминокислот, увеличение продукции активных форм кислорода (АФК), окислительный стресс, гибель клетки путем апоптоза и некроза [5]. Причем вклад АФК и АОС в развитие некроза, запуск и реализацию апоптотического сигнала остается дискутабельным.
Наибольшие сдвиги в ткани головного мозга развиваются в течение первых часов и первой недели жизни, хотя они и становятся очевидными к возрасту 9-12 мес [6]. Спустя 11-19ч простгипоксического периода в патологический процесс вовлекается все большее число нейронов и областей мозга. В подкорковых ядрах появляются измененные клетки, а в коре - они начинают доминировать. Диффузный кариоцитолиз в коре больших полушарий сочетается с дистрофическими изменениями нейроглии [7]. Экспериментально установлено, что у незрелых крыс и морских свинок спустя 5 ч после перенесенной гипоксии ДНК остается интактной, однако к концу 1-х суток в corpus striatum появляются первые признаки деградации, к 3-му дню они отмечаются в коре и гиппокампе [8]. Таким образом, высший критический порог для церебральных повреждений наблюдается спустя 10 ч после гипоксии/реоксигенации, а в течение первых 72 ч жизни к первичным повреждениям присоединяются вторичные, развивающиеся вследствие недостаточной компенсаторной способности тканей мозга [5,7,8,9]. Учитывая ведущую роль окислительного стресса в развитии как первичных, так и вторичных нарушений при гипоксии/реоксигенации, определение собственных эндогенных резервов антиоксидантной системы представляется актуальной задачей.
Целью работы явилось исследование активности ключевых ферментов антирадикальной и антипероксидной защиты – СОД и каталазы в тканях головного мозга, крови и субклеточных фракциях печени для установления мощности компонентов антиоксидантной системы организма и их перераспределение при хронической внутриутробной гипоксии и реоксигенации в эксперименте.
Материалы и методы. У 19 белых беспородных крыс-самок, беременных сроком 7-10 дней весом 180-200г в хроническом эксперименте воспроизводилась общая гипобарическая гипоксия. Животных 10 кратного погружали в специальную камеру, где в течение 1 часа создавалось давление 41,1 кПА, что соответствует подъему на высоту 7000м. После родов произведено обследование новорожденных крысят (n=104) на 1, 3, 5, 8, 10, 12 дни жизни. Забой животных проводили путем декапитации под эфирным наркозом. Из мозга, печени готовили гомогенаты. Среда выделения состояла из 0,125М KCl. Из гомогенатов печени выделяли митохондриальную (МХ) и микросомальную (МС) фракции методом дифференциального центрифугирования по Shnaider. Активность каталазы определяли перманганатометрическим способом по С.М. Зубковой и соавт. [10] Активность СОД исследовали по методу Mirsa P.H., Fridovich S. в модификации О.С. Брусова с соавт.[11].
Результаты и их обсуждение. Изучение активности ферментов антирадикальной и антипероксидной защиты в нашей работе выявило следующее. При рождении у крысят, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию, активность СОД была снижена, а активность каталазы – повышена во всех исследуемых биологических средах. Примечательно, что снижение активности СОД было ярко выражено в МС-фракции печени, а каталазы – в крови (в 1,9 раза ниже контроля на 3 сутки эксперимента) (табл.).
Таблица.
Активность СОД (Т%) и каталазы (ммоль Н2О2 / млн эритроцитов; ммоль Н2О2 / г ткани) в динамике внутриутробной гипоксии/реоксигенации
|
СОД |
Контр (n=14) |
При рождении (n=15) |
24ч (n=14) |
3 сут (n=12) |
5 сут (n=16) |
8 сут (n=16) |
10 сут (n=15) |
12 сут (n=16) |
|
Мозг |
55,9± 2,6 |
48,2± 4,5 |
16,1± 1,3* |
25,0± 3,1* |
27,1± 2,8* |
41,3± 2,6* |
51,0± 4,4 |
57,2± 4,1 |
|
кровь |
82,0± 4,7 |
69,1± 3,8* |
54,2± 3,3* |
60,3± 5,1* |
62,1± 4,9* |
67,0± 3,3* |
65,4± 3,0* |
68,1± 2,9* |
|
МС |
85,3± 4,1 |
40,2± 1,9* |
31,0± 3,0* |
26,4± 2,8* |
28,0± 2,2* |
29,1± 1,8* |
33,2± 2,7* |
37,0± 3,3* |
|
МХ |
90,0± 4,4 |
87,2± 2,2 |
69,9± 1,7* |
65,1± 1,3* |
68,0± 1,4* |
69,0± 1,4* |
71,2± 1,1* |
71,9± 2,1* |
|
Каталаза |
контроль |
При рождении |
24ч |
3 сут |
5 сут |
8 сут |
10 сут |
12 сут |
|
Мозг |
22,0± 2,4 |
26,3± 3,0 |
16,0± 0,6* |
15,2± 0,9* |
17,0± 1,2* |
16,9± 0,2* |
18,0± 0,9* |
17,0± 1,1* |
|
кровь |
38,2± 2,5 |
42,1± 3,3 |
32,7± 3,0* |
19,8± 1,5* |
24,1± 1,8* |
29,2± 1,1* |
30,0± 1,7* |
34,1± 1,8 |
|
МС |
21,2± 0,5 |
24,0± 0,7* |
17,9± 0,3* |
17,0± 0,6* |
17,5± 0,6* |
18,0± 0,6* |
18,4± 0,3* |
18,8± 0,6 |
|
МХ |
62,3± 1,3 |
78,5± 2,0* |
56,3± 1,8* |
51,0± 2,2* |
51,8± 2,0* |
57,1± 1,9* |
55,3± 1,9 |
58,4± 1,6 |
Примечание: * - достоверно по отношению к контролю
Динамика активности СОД и каталазы в гомогенате мозга в период реоксигенации была однонаправленной и имела тенденцию выраженному снижению с последующим постепенным увеличением, однако, не достигающим контрольных величин. Причем, наиболее низкие значения активности СОД наблюдались через 24 часа (в 3,5 раза ниже контроля), а каталазы - на 3 сутки (в 1,5 раза ниже контроля) постнатального периода. В течение первой недели жизни крысят активность СОД и каталазы в гомогенате мозга была достоверно ниже нормальных показателей. Начиная с 8 дня жизни, активность СОД восстанавливалась, и к 10-12 дню наблюдения была сравнима с контролем, а активность каталазы в эти сроки в гомогенате мозга была снижена на 23%. Отметим, что восстановление активности СОД без соответствующей активации каталазы не имеет положительного эффекта, т.к. СОД утилизирует супероксиданион с образованием Н2О2. Повышение в клетке активности СОД путем специфической активации или сверхэкспрессии, не сопровождающееся активацией каталазы или пероксидаз, само по себе является цитотоксичным, поскольку для жизнеспособности клетки важен баланс между активностями СОД и ферментов, разрушающих перекись водорода [12,13]. Примечательно, что ткань мозга характеризовалась относительно невысокой каталазной активностью - 22,0± 2,4 Н2О2 ммоль / г ткани у крысят контрольной группы; а в период реоксигенации у животных опытной группы ее уровень был снижен на 22-29% на 5-12 сутки жизни.
Исходно низкая активность каталазы в гомогенате мозга и ее последующее угнетение в периоде реоксигенации, обнаруженное нами, согласуется с литературными данными [2,5], и свидетельствует о недостаточных компенсаторных способностях мозговой ткани, необходимости коррекции экзогенными антиоксидантами, начиная с первых часов жизни на протяжении 5-7 дней, когда в динамике определяется тенденция к восстановлению активности СОД и каталазы.
Печень, являясь депо антиоксидантов в организме и выполняя обезвреживающую функции по детоксикации от продуктов липопероксидации, играет важную роль в адаптационной реакции организма на хроническую внутриутробную гипоксию и непосредственно вовлекается в патологический процесс. Нами обнаружено, что в МХ-фракции печени активность СОД изменялась волнообразно: несколько увеличиваясь, хотя, достоверно не отличаясь от контроля при рождении, а затем снижаясь в 1,3-1,4 раза относительно контроля на 3-12 сутки наблюдения. В МС фракции печени активность СОД оставалась достоверно пониженной во все сроки наблюдения, как после рождения, так и в период реоксигенации: она была ниже контроля в 2,1; 2,8; 3,2; 3,0; 2,9; 2,6 раза при рождении, на 1,3,5,8,10 и 12 сутки жизни соответственно.
Активность каталазы в микросомально-цитозольной фракции печени была увеличена на 12% при рождении и понижена на 18 и 24% на 1 и 3 сутки реоксигенации соответственно. С 5 дня имело место постепенное увеличение каталазной активности, которое, однако, не достигало уровня контроля, оставаясь ниже его на 21, 17,15 и 13% в течение 5, 8,10 и 12 суток реоксигенации. В МХ-фракции печени динамика изменений активности каталазы была аналогичной: при рождении активность каталазы увеличивалась на 21%, а затем снижалась к 3-5 суткам на 20-22%, постепенно увеличиваясь к 10-12 суткам наблюдения, достоверно не отличаясь от контроля в этот срок.
В крови уровень активности каталазы непосредственно после рождения недостоверно увеличивался, а затем понижался в 1,2; 1,9; 1,6 раза по сравнению с контролем на 1-5 сутки после рождения. На 8-10 день реоксигенации уровень каталазы крови был снижен в 1,3 раза, достоверно не отличаясь от контроля на 12 сутки жизни.
Как видно из вышеизложенного, при хронической внутриутробной гипоксии и последующей реоксигенации происходят изменения в системе антирадикальной и антипероксидной активности организма, выраженные как в ткани головного мозга, так и в печени. Обсуждая полученные данные, подчеркнем, что СОД и каталаза, являясь мощным антиокислительным тандемом, обеспечивают защиту от супероксиданиона и перекиси водорода, образующихся как внутри клеток, так и во внеклеточном пространстве, поддерживая оптимальный для жизнедеятельности уровень АФК. При этом защита клеточных структур от повреждающего действия АФК, продуцирующихся внутри клетки (эндогенные АФК) и воздействующих извне (экзогенные АФК) организуется различным образом. Образовавшиеся карбонильные продукты утилизируются в цитозоле, а конъюгированные диены, триены и продукты рекомбинации липидных радикалов, по-видимому, не утилизируются, а накапливаются в клетках вместе с окисленными белками в виде «липофуциновых гранул» [14].
При этом изоферменты СОД представлены Cu/Zn СОД - СОД1, экспрессирующейся в виде димеров в цитозоле; Mn СОД - СОД2 - существующей в виде тетрамеров в митохондриях и тетрамеров внеклеточной СОД – EC-СОД - СОД3 [15]. В ЦНС СОД1 обнаруживается в цитоплазме нейронов и эпиндиме, в ядрах глиальных клеток; СОД2 содержится в митохондриях нейронов и эпиндиме [16].
Наличие множественных форм СОД имеет глубокий биологический смысл, поскольку АФК не способны проникать через клеточные мембраны и должны и инактивироваться в местах синтеза – митохондриях и цитозоле. Понижение активности при воздействии неблагоприятных факторов наиболее более характерно для цитоплазматической СОД1; активность митохондриальной СОД2 изменяется в меньшей степени и в более поздний период [17], возможно за счет различной интенсивности продукции АФК в митохондриях и микросомах и согласуется с полученными нами результатами. Кроме того, СОД2 является необходимой для функциональной активности митохондрий, поскольку при мутации ее гена резко понижается активность аконитазы – фермента цикла трикарбоновых кислот, у мутантов по СОД2 на 20% увеличивается риск развития амиотрофического склероза и других нейродегенеративных заболеваний, продолжительность жизни и риск преждевременной смерти экспоненциально увеличиваются при уменьшении активности СОД2 [16,17].
При хронической гипоксии наблюдается недостаточность СОД1 и СОД2, а снижение рН и перекись водорода инактивируют все изоформы СОД. В основе инактивации Cu-Zn-СОД лежит протонирование остатка гистидина, входящего в активный центр фермента [2,18]. При недостатке СОД супероксидные радикалы могут давать неблагоприятные эффекты, главным образом в результате двух реакций: образования ионов двухвалентного железа из трехвалентного и связывания оксида азота с образованием пероксинитрита. В отличии от окиси азота пероксинитрит стимулирует захват кальция митохондриями, разобщая тем самым процессы тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования, что в итоге приводит к падению энергетического потенциала нервных клеток с вытекающими отсюда последствиями [18,19]. Кроме того, пероксинитрит, связывая NO, нивелирует его способность расширять сосуды, что способствует вазоспазму, усугубляющему гипоксию.
Окислительная инактивация ферментов защитных систем организма способствует усилению интенсивности свободно-радикальных процессов и нарушению репарации окислительных повреждений нуклеиновых кислот.
Транзиторная гипоксия способствует увеличению продукции АФК в цитозоле и митохондриях культивируемых нейронов, подвергнутых гипоксии/реоксигенации, увеличению активности СОД и снижению как активности каталазы, так и экспрессии ее генов в первые 48 часов реоксигенации [3,20]. При этом наблюдается значимое увеличение активности Mn-СОД, равно как и активация синтеза ее мРНК, а активность Cu, Zn-СОД в астроцитах не изменяется, хотя наблюдается увеличение экспрессии этих генов [21]. Это указывает на то, что Mn-СОД является наиболее индуцибельной изоформой СОД [20]. Интересно, что реоксигенация подобного эффекта не оказывает [21]. В других исследованиях было показано, что гипоксия вызывает угнетение транскрипции генов всех изоформ СОД, но способствует повышению активности уже синтезированных ферментов; реоксигенация, напротив, способствует повышению экспрессии генов СОД [22], чем, вероятно, и обусловлено постепенное повышение количества фермента и его активности в постгипоксическом периоде, наблюдаемое в нашем эксперименте. Установлено, что острая аноксия культуры клеток способствует резкому снижению суммарной СОД за счет снижения продукции супероксиданиона в условиях дефицита кислорода, а реоксигенация вызывает некоторое увеличение активности всех изоформ СОД, причем в большей степени Mn-СОД [20].
Как показали результаты наших исследований, хроническая внутриутробная гипоксия вызывает понижение активности СОД и повышение активности каталазы, а в период реоксигенации наблюдается угнетение активности обоих ферментов с тенденцией к постепенному увеличению в динамике. Восстановление активности СОД до уровня контроля к 12 дню эксперимента наблюдается в ткани головного мозга, что, на фоне низкой активности каталазы не указывает на нормализацию патологического процесса.
Это согласуется с литературными данными, где на основании морфологических исследований показано, что структурно-функциональные изменения в головном мозге наблюдаются в первые 10-12 дней жизни [23], а их последствия могут сохраняться в течение 12-14 месяцев и более [6,24].
На основании литературных данных, мы полагаем, что волнообразная динамика активности СОД обусловлена понижением транскрипции ее генов в период гипоксии и индукцией транскрипции в период реоксигенации под действием увеличения количества АФК. Именно этим обусловлено постепенное восстановление активности СОД в динамике постнатального периода.
Выводы.
1. Хроническая внутриутробная гипоксия плода приводит к активации ферментов антирадикальной и антипероксидной защиты, мобилизации антиокислительной защиты, а реоксигенация вызывает угнетение их активности, выраженное в неодинаковой степени в головном мозге и субклеточных фракциях печени.
2. В течение первых 12 дней постнатального периода активность фермента антирадикальной защиты СОД в ткани головного мозга восстанавливается, однако активность каталазы остается пониженной, что указывает на отсутствие нормализации процесса.
3. Активность каталазы и СОД в микросомальной фракции печени в раннем постнатальном периоде угнетена, что свидетельствует о снижении мощности АОС организма и исчерпании депо антиоксидантов в печени, а также о возможном ингибировании детоксикационной функции печени, осуществляемой ферментами микросомальной окислительной системы.
Литература:
1. Хохлов А.П. Молекулярные основы патогенеза заболеваний нервной системы. Возможности метаболической терапии // Биология и медицина, 2005;3:32-39.
2. Суслина З.А., М.Ю. Максимова. Концепция нейропротекции: новые возможности ургентной терапии ишемического инсульта // Нервные болезни, 2004;3:4-7.
3. Lièvre V., P. Becuwe, A. Bianchi, C. Bossenmeyer-Pourié, V. Koziel, P. Franck, M. B. Nicolas, M. Dauça, P. Vert and J. L. Daval. Intracellular generation of free radicals and modifications of detoxifying enzymes in cultured neurons from the developing rat forebrain in response to transient hypoxia // Neuroscience. 2001;105(2):287-297.
4. Пальчик А.Б., Федорова Л.А. Перивентрикулярная лейкомаляция. СПбМА. – 2005.-46 с.
5. Болдырев А.А.Окислительный стресс и мозг // СОЖ, 2005;8(4):4-9.
6. Студеникин В.М., В.И. Шелковский, Л.Г. Хачатрян, Н.В. Андреенко, Г.У. Классификация перинатальных повреждений центральной нервной системы у детей по Студеникину // Практика педиатра, 2008;1:17-19.
7. Барашнев Ю.И. Принципы реабилитационной терапии перинатальных повреждений нервной системы у новорожденных и детей первого года жизни // Российский вестник перинатологии и педиатрии, 1999;1:7-13.
8. Калиниченко С.Г., Матеева Н.Ю. Морфологическая характеристика апоптоза и его значение в нейрогенезе //Морфология,2007;131(2):16-28.
9. Отеллин В.А. Формирование патологий головного мозга в эмбриональный период. // Биология и медицина,2004;2:32-39.
10. Зубкова С.М., Бах А.Н. Количественное определение активности каталазы крови // Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина, 1976:81-83.
11. Брусов О.С., Герасимов А.И., Панченко Л.Ф. Влияние природных ингибиторов радикальных реакций на автоокисление адреналина // Бюлл. эксперим. биол. и мед. – 1976;87(1):33-35.
12. Бизенкова М.Н. Общие закономерности метаболических расстройств при гипоксии различного генеза и патогенетическое обоснование принципов их медикаментозной коррекции // Автореф. дисс. к.м.н., Саратов, 2008.-25с.
13. Зайцев В.Г., Островский О.В., Закревский В.И. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия. //Эксперим. Клин.фармакол.2003;66(4):66-70.
14. Зайцев В.Г., Закревский В.И. Защита клеток от экзогенных и эндогенных активных форм кислорода: методологические подходы к изучению. //Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии: Тр. научн. конф., посвященной 100-летию каф. биохимии Санкт-Петербургского гос. мед. ун-та им. акад. И.П.Павлова 15-17 окт.1998.- СПб, 1998;2:401-405.
15. Valeria Cizewski Culotta, Mei Yang, Thomas V. O'Halloran. Activation of superoxide dismutases: Putting the metal. //Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, 2006;1763(7):747-758.
16. Anirban Paul, Amy Belton, Sanjay Nag, Ian Martin, Michael S. Grotewiel, Atanu Duttaroy. Reduced mitochondrial SOD displays mortality characteristics reminiscent of natural aging // Mechanisms of Ageing and Development, 2007;128(11-12):706-716.
17. Fábio Rogério, Simone A. Teixeira, Alexandre César Santos de Rezende, Rafael Cofiño de Sá, Luciano de Souza Queiroz, Gilberto De Nucci, Marcelo Nicolás Muscará, Francesco Langone. Superoxide dismutase isoforms 1 and 2 in lumbar spinal cord of neonatal rats after sciatic nerve transection and melatonin treatment //
Developmental Brain Research, 2005;154(2):217-225.
18. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах. Соровский образовательный журнал.2000;2:13-18.
19. Биленко М.В., В.Г.Ладыгина, С.В.Федосова. Сравнительная оценка цитотоксического эффекта перекиси водорода и фактора некроза опухоли альфа на неишемизированные и ишемизированные эндотелиальные клетки //Вопросы медицинской химии, 1999;5:4-7.
20. Marta Monari, Valerio Matozzo, Jurgen Foschi, Maria Gabriella Marin, Otello Cattani. Exposure to anoxia of the clam, Chamelea gallina: II: Modulation of superoxide dismutase activity and expression in haemocytes // Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,2005;325(2):175-188.
21. Chiang-Shan Niu, Cheng-Kuei Chang, Lieh-Sheng Lin, Shuo-Bin Jou, Daih-Huang Kuo, Shue-Sen Liao, Juei-Tang Cheng. Modification of superoxide dismutase (SOD) mRNA and activity by a transient hypoxic stress in cultured glial cells // Neuroscience Letters, 1998;251:145-148.
22. Valérie Lièvre, Philippe Becuwe, Arnaud Bianchi, Violette Koziel, Patricia Franck, Henri Schroeder, Pierre Nabet, Michel Dauça and Jean-Luc Daval. Free radical production and changes in superoxide dismutases associated with hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis of embryonic rat forebrain neurons in culture // Available online 13 December 2000.
23. Меньшанов П.Н. Эффекты глюкокортикоидов на экспрессию генов апоптоза в неонатальном мозге крыс // Автороеф. дис. к.б.н., Новосибирск,2007.-16с.
24. Arabadzisz D., T. F. Freund Changes in excitatory and inhibitory circuits of the rat hippocampus 12–14 months after complete forebrain ischemia
