Введение. Аутофагия – это способ доставки компонентов цитоплазмы для лизосомального расщепления. Она является сложным, генетически запрограммированным процессом, функционирующим как в нормальных клетках для обновления органелл, так и являющимся механизмом клеточной гибели. Выделяют три основных механизма аутофагии: макроаутофагия, микроаутофагия и шаперон-опосредованная аутофагия, имеющие как морфологические, так и функциональные различия [4]. Нас в первую очередь интересует макроаутофагия (далее по тексту – аутофагия), так как она является основным путем накопления аутоантигенов, используемых для антигенпрезентации эпителиальными клетками мозгового вещества тимуса [5]. Доказано [6], что эпителиоциты в тимусе характеризуются высоким уровнем аутофагии, намного превосходящем уровни в других клетках и низким уровнем фагоцитоза. Нарушение процесса аутофагии приводит к дефектам негативной селекции.
В общих чертах, механизм можно представить следующим образом. Сначала происходит накопление Aire-зависимых антигенов в цитоплазме клетки, обертывание помеченных агрегатов мембраной с формированием аутофагосомы, которая затем сливается с поздними эндосомами и лизосомами. В результате слияния образуются мультивезикулярные и мультиламеллярные структуры – поздние эндосомные компартменты, содержащие различные везикулы с гетерогенным содержимым и секретирующие экзосомы. В мультивезикулярных тельцах возможны два механизма: кросс-презентация или межклеточный перенос (выделение готовых для презентации аутоантигенов для дендритных клеток в составе экзосом), связывание антигенов с молекулами MHC II (для презентации CD4+ тимоцитам на поверхности клетки). Антиген-презентирующие клетки демонстрируют высокий уровень эндоцитоза и содержат мультивезикулярные тельца, которые являются местами связывания антигенных белков с МНС II. Для МНС I используется протеосомный путь и антигены презентируются для CD8+ [6].
Аутофагия также является ключевым механизмом аутофагической гибели (разновидность запрограммированной клеточной смерти) [7]. Аутофагия позволяет эффективно разрушать структурные компоненты клеток, снижая нагрузку на фагоциты. Аутофагическая смерть характеризуется наличием большого числа аутофагосом разных стадий развития. Морфологически процесс аутофагии характеризуется наличием аутофагосом, имеющих двойную мембрану (как ранних, так и поздних аутофагосом). Ядро клетки при этом не содержит конденсированного храматина и разрывов ДНК (TUNEL-метод дает негативные результаты) [2].
Целью настоящего исследования было выявление ультраструктурных особенностей аутофагии в эпителиальных клетках телец Гассаля тимуса человека. Аутофагия изучается преимущественно in vitro, поэтому данные, полученные in vivo и у человека, представляют значительный как теоретический, так и практический интерес.
Материалы и методы. Объектом исследования служил операционный материал тимуса (30 случаев), удаленный по хирургическим показаниям. Операции проводились в Минском детском кардиохирургическом центре по поводу минимальных сердечно-сосудистых пороков у детей в возрасте 1-4 месяца, в анамнезе которых отсутствовали инфекционные заболевания, иммунодефицитные состояния, прием стероидных гормонов, иммунодепрессантов. Электронно-микроскопическое исследование проводилось на электронном микроскопе JEM 100 CX (Япония). Образцы фиксировались в 2,5% растворе глютаральдегида и 1% растворе четырехокиси осмия и заливались в аралдит. Срезы изготавливали на ультратоме ЛБК (Швеция) и контрастировали цитратом свинца.
Результаты и их обсуждение. Аутофагосомы в значительном количестве наблюдались в эпителиальных клетках как мозгового вещества, так и в эпителиальных клетках телец Гассаля. Нами обнаружены значительные морфологические различия процессов аутофагии между эпителиоцитами мозгового вещества и эпителиоцитами телец Гассаля (рисунок 1).
В эпителиальных клетках мозгового вещества обнаруживается умеренное количество аутофагосом (рисунок 1а, 1б, 1д). Они варьируют в размерах, составляя в среднем 0,4-0,7 мкм. Органеллы в составе аутофагосом не обнаруживаются. В округлых эпителиальных клетках мозгового вещества, содержащих микроворсинки, наблюдается активный процесс аутофагии с формированием множества экзосом. В тех местах, где эпителиальные клетки контактируют с мембраной дендритных клеток, обнаруживается активный экзоцитоз содержимого везикул и поглощение секретируемых веществ дендритными клетками (рисунок 1б). Отметим, что в эпителиальных клетках мозгового вещества мультивезикулярные тельца встречаются очень редко (рисунок 1в). Такие клетки находятся в контакте с дендритными клетками, что свидетельствует об активном процессе кросс-презентации. Контактов с другими типами клеток мы не наблюдали.
Значительно большее количество аутофагосом наблюдалось в округлых эпителиальных клетках первого типа (далее по тексту – эпителиальных клеток телец Гассаля), что свидетельствует об усилении процесса аутофагии. Внутренние округлые клетки содержат большое количество вторичных аутофагосом, которые, сливаясь, занимают большую часть клетки, располагаясь между пучками кератиновых филаментов. В уплощенных клетках большая часть цитоплазмы занята кератиновыми тонофиламентами и не содержит аутофагосом.
Рис. 1. Процесс аутофагии в тельцах Гассаля и эпителиальных клетках тимуса человека. Электронно-микроскопическое исследование. Обозначения: 1 – ядро эпителиальной клетки, 2 – поздние аутофагосомы, 3 – мультивезикулярные тельца, 4 – мультивезикулярное тельце, 5 – ранние аутофагосомы, 6 – экзоцитоз везикул, 7 – кератиновые тонофиламенты. Увеличение 10000х.
Мультивезикулярные тельца типичного строения не характерны для эпителиоцитов телец Гассаля. Обычно в тельцах они представлены небольшими структурами, содержащими 4-6 везикул различного размера с гомогенным содержимым. Также характерными для эпителиальных клеток телец являются мультиламеллярные структуры (рисунок 1е) – производные лизосомального аппарата, функция которых заключается в связывании антигенных белков с МНС II [4].
Важным отличием от эпителиальных клеток мозгового вещества является практически полное отсутствие экзосом в эпителиоцитах телец Гассаля. Однако тельца Гассаля характеризуются большим количеством микроворсинок, переплетающихся друг с другом. Известно [3], что микроворсинки способны не только абсорбировать, но и секретировать различные вещества. Микроворсинки присутствуют на клетках всех слоев тельца, образуя своеобразные расщепления, которые содержат переплетающиеся микроворсинки, ориентированные параллельно длиннику клеток. Максимальное количество микроворсинок наблюдается на наружной поверхности периферических клеток телец, где они, переплетаясь между собой и образуя трехмерную сеть. Возможно, что микроворсинки эпителиоцитов телец Гассаля секретируют аутоантигены. В пользу этого предположения может свидетельствовать наблюдение, что на периферии тельца Гассаля обнаруживается взаимодействие неэпителиальных клеток (тимоцитов, дендритных клеток) с микроворсинками эпителиальных клеток.
После включения в состав телец, в эпителиоцитах наблюдается увеличение количества ранних аутофагосом, что может отражать усиление процессов расщепления структурных компонентов клетки. Количество же экзосом резко уменьшается, появляются мультивезикулярные тельца. Количество аутофагосом растет, в ядре таких клеток наблюдается появление глубоких инвагинаций кариолеммы, которые делят ядро на многочисленные сегменты. По мере накопления цитокератинов поздние аутофагосомы сливаются, заполняя большие пространства цитоплазмы, ядро распадается на мелкие фрагменты, и клетка вступает на путь аутофагической гибели (механизм лизиса клетки описан нами ранее [1]).
Заключение. Таким образом, выявлены морфологические эквиваленты процессов аутофагии и антигенпрезентации в тимусе человека и показаны различия в данных процессах между эпителиальными клетками мозгового вещества и эпителиальными клетками телец Гассаля. Эпителиальные клетки мозгового вещества характеризуются наличием полостей в цитоплазме, слабым развитием микроворсинок, большим количеством экзосом и взаимодействием с дендритными клетками. Эпителиальные клетки телец Гассаля характеризуются выраженным развитием микроворсинок, малым количеством экзосом, присутствием мультивезикулярных и мультиламеллярных телец и взаимодействием как с дендритными клетками, так и тимоцитами. Полученные данные свидетельствуют о преобладании кросс-презентации антигенов дендритным клеткам в мозговом веществе, и как прямой антиген-презентации, так и кросс-презентации в эпителиоцитах теле Гассаля. Накопление аутофагосом в клетках внутреннего слоя телец Гассаля и характер разрушения ядра клеток (без конденсации хроматина) свидетельствует о аутофагическом характере их гибели.
Литература:
Беловешкин А.Г., Студеникина Т.М. // Морфология постклеточных структур телец Гассаля тимуса человека в норме. Медицинский журнал, 2010, 4, стр. 26-28.
Lockshin R.A., Zakeri Z. 2004. Apoptosis, autophagy, and more. IJBCB. 36: 2405-2419.
Piper RC, Katzmann DJ. Biogenesis and function of multivesicular bodies. Annu Rev Cell Dev Biol. 2007; 23: 519-47.
Marzesco AM, Wilsch-Bräuninger M, Dubreuil V, Janich P, Langenfeld K, Thiele C, Huttner WB, Corbeil D. FEBS Lett. 2009 Mar 4; 583(5): 897-902. Release of extracellular membrane vesicles from microvilli of epithelial cells is enhanced by depleting membrane cholesterol.
Münz Christian Antigen Processing by Macroautophagy for MHC Presentation Front Immunol. 2011; 2: 42.
Mizushima N, Ohsumi Y & Yoshimori T. 2002; Autophagosome formation in mammalian cells. Cell Struct. Funct. 27: 421–429.
Nedjic J, Aichinger M, Emmerich J, Mizushima N, Klein L. Autophagy in thymic epithelium shapes the T-cell repertoire and is essential for tolerance. Nature 2008; 455: 396–400.
Tsujimoto Yand S. Shimizu Another way to die: autophagic programmed cell death Cell Death and Differentiation (2005) 12, 1528–1534.