Роль телец Гассаля тимуса человека в позитивной и негативной селекции тимоцитов

Введение. Известно, что тимус представляет собой первичный орган иммунной системы, в котором происходит дифференцировка предшественников Т-лимфоцитов в зрелые клетки. Процесс дифференцировки обеспечивается сложным трехмерным микроокружением тимуса, состоящим из различных клеточных популяций, активно взаимодействующих как между собой посредством ряда хемокинов, адгезионых молекул и иных механизмов [3].

Одним из наименее изученных компонентов тимуса являются тельца Гассаля, которые представляют собой концентрические скопления эпителиальных клеток в мозговом веществе долек тимуса. Тельца Гассаля взаимодействуют с различными типами клеток, но их взаимодействие с тимоцитами до настоящего времени остается недостаточно изученным [4]. Так, Blau [5] считал, что тельца обладают фагоцитарной активностью и способны разрушать гибнущие тимоциты. Эта теория получила широкое распространение и явно, или неявно поддерживается большим количеством исследователей. Bodey [3] объясняет зернистость в эпителиальных клетках фрагментами разрушенных тимоцитов, не приводя удовлетворительных доказательств в поддержку этой точки зрения. Также в пользу его предположения интерпретировались такие факты как быстрое попадание ДНК тимоцитов в просвет телец и высокая активность лизосомальных ферментов в клетках телец Гассаля [3]. Несмотря на многочисленные исследования, так и не был описан механизм попадания тимоцитов в тельца Гассаля. Наряду с описанной теорией, существуют и противоположные мнения, которые доказывают, что тельца Гассаля напротив, способствуют дозреванию тимоцитов. Некоторые исследователи обращают внимание на высокую плотность тимоцитов возле телец Гассаля. Senelar [12] описал контакты клеток телец с тимоцитами и выдвинул предположение, что тельца являются местами дозревания тимоцитов.

Таким образом, существует ряд противоречий в описании как структурных особенностей взаимодействия тимоцитов с тельцами Гассаля, так и в интерпретации полученных данных. Целью настоящего исследования было выявление закономерностей взаимодействия тимоцитов и телец Гассаля тимуса человека и интерпретировать полученные результаты в свете современных научных данных.

Материалы и методы. Объектом исследования служил операционный материал тимуса, удаленный по хирургическим показаниям. Операции проводились в Минском детском кардиохирургическом центре по поводу минимальных сердечно-сосудистых пороков у детей в возрасте 1-4 месяца, в анамнезе которых отсутствовали инфекционные заболевания, иммунодефицитные состояния, прием стероидных гормонов, иммунодепрессантов.

Микроскопическое исследование проводилось с помощью компьютерного анализатора изображения на базе цифровой камеры UMD-300 («Gsmserver», Тайвань) и микроскопа Zeiss Axiolab («Carl Zeiss AG», Германия). Образцы тимуса (20 случаев) фиксировали в нейтральном формалине, заливали в парафин, готовили серийные срезы толщиной 7 мкм. Окраска препаратов проводилась гематоксилин-эозином (с модификациями для лучшей визуализации эозинофилов), по Романовскому-Гимза, кислым фуксин-альциановым синим-гематоксилином и по методу Пачини (с модификациями автора, позволяющими выявить кератиновое ядро телец Гассаля). Иммуногистохимическое исследование проводилось с антителами к CD3, CD5, CD25, CD30, CD68. Все антитела производства DAKO, США. Ядра клеток докрашивались гематоксилином.

Электронно-микроскопическое исследование проводилось на электронном микроскопе JEM 100 CX (Япония). Образцы фиксировались в 2,5% растворе глютаральдегида и 1% растворе четырехокиси осмия и заливались в аралдит. Срезы изготавливали на ультратоме ЛБК (Швеция) и контрастировали цитратом свинца.

Полученные результаты. Использование маркера CD3, который является общим для всех Т-лимфоцитов, показало, что лимфоциты в мозговом веществе распределены достаточно равномерно, однако периферический слой телец Гассаля окружен лимфоцитами плотно (рисунок 1а). В полости телец тимоциты, за редким исключением, отсутствуют. Часто можно обнаружить CD3-положительные клетки между эпителиоцитами телец. Таким образом, тимоциты не вносят существенного вклада в строение телец и структурное взаимодействие между ними выражено незначительно.

Тем не менее, исследование определенных субпопуляций тимоцитов показало их концентрацию возле телец Гассаля (рисунок 1б, 1в). Плотность тимоцитов субпопуляций CD25 и СD30 встречаются возле телец Гассаля намного чаще, чем в других отделах мозгового вещества. При ультраструктурном исследовании на периферии тельца Гассаля обнаруживается тесное взаимодействие тимоцитов с микроворсинками эпителиальных клеток. Ультрамикроскопическое исследование выявило большое количество тимоцитов возле периферических клеток, причем отростки тимоцитов контактируют с микроворсинками эпителиальных клеток и мембраной многочисленных дендритных клеток. Часто можно наблюдать непосредственный контакт клеточных мембран. Данные наблюдения могут свидетельствовать о тесном взаимодействии данных типов клеток.

Рис. 1. Различные субпопуляции тимоцитов в мозговом веществе тимуса. Иммуногистохимическая реакция на CD3 (А), CD25 (В),CD30 (Б), гистохимическая реакция на нуклеиновые кислоты (Г). Обозначения: 1 – тельце Гассаля, 2 – имуннореактивные тимоциты, 3 – апоптотические тимоциты. Увеличение 1000х.

Рис. 2. Апоптоз тимоцитов и тельца Гассаля мозгового вещества тимуса. Электронно-микроскопическое исследование. Апоптотическое тельце (А), макрофаг с фагоцитированным апоптотическим тимоцитом (Б), апоптотические тельца в полости (В) и в стенке (Г) тельца Гассаля. Обозначения: 1 – апоптотическое тельце, 2 – эпителиальная клетка тельца, 3 – полость тельца, 4 – тимоциты, 5 – макрофаг. Увеличение 10000х.

Следующим важным наблюдением было обнаружение большого количества тимоцитов на различных стадиях апоптоза (рис. 2). Апоптотические тимоциты встречаются возле телец Гассаля намного чаще, чем в других отделах мозгового вещества. При гистологических методах окраски, хорошая визуализация апоптоза достигается при использовании гистохимических методов окраски на нуклеиновые кислоты (рисунок 1г). Ультрамикроскопически можно обнаружить апоптотические тимоциты как в виде отдельных апоптотических телец, так и в виде клеток с конденсированным хроматином. Топография апопоптотических тимоцитов различна: преимущественно они встречаются непосредственно возле периферического слоя телец Гассаля, реже – между эпителиальными клетками и еще реже – в полости телец регрессивного типа (рисунок 2). При этом часто обнаруживаются апоптотические тельца в цитоплазме макрофагов (рисунок 2б). Ранее [1] мы упоминали, что CD 68-положительные макрофаги в мозговом веществе сконцентрированы возле телец Гассаля всех стадий развития, а не только возле стареющих форм, в разрушении которых они принимают участие. Таким образом, объяснением этого наблюдения, может быть фагоцитоз макрофагами погибающих апоптозом тимоцитов. Плотность макрофагов в мозговом веществе намного ниже, чем в корковом веществе, что, на наш взгляд, отражает различия в интенсивности апоптоза в данных зонах.

Обсуждение полученных результатов. Полученные результаты подтверждаются данным исследования апоптоза в тельцах с помощью TUNEL-метода [7]. Он показал, что все CD3-положительные клетки в тельцах являются апоптотическими, причем принадлежат они различным субпопуляциям (CD4+ CD8+ CD4+CD8+). Таким образом, тельца участвуют в утилизации различных типов аутореактивных тимоцитов. Doulek также показал, что тельца – это единственное место апоптоза в мозговом веществе тимуса. Движение тимоцитов in vivo с помощью двухфотонной микроскопии позволяет проследить движение отдельных клеток [4]. Показано, что после взаимодействия с дендритными клетками, тимоцит не сразу подвергается апоптозу а еще некоторое время мигрирует по мозговому веществу. Для объяснения полученных данных необходимо привлечь исследования по хемокинам, регулирующим миграцию тимоцитов.

Тельца Гассаля секретируют несколько важных для движения тимоцитов хемокинов [2, 8]. К их числу относятся MDC (macrophage-derived chemokine, хемоаттрактиант для CD4+CD30+ клеток) и Mig (хемоатрактант для CD8 клеток и NK-клеток). Они действуют следующим образом. Так, при попадании тимоцитов в мозговое вещество, тимоцит проходит процесс негативной селекции, взаимодействуя с дендритными клетками. Если тимоцит несет Т-клеточный рецептор, потенциально реактивный к своим антигенам, то при взаимодействии с дендритной клеткой, происходит его активация. Тимоциты, активированные аутогомологичными пептидами продуцируют ИЛ-4, который ауто- и паракринно вызывает высокую экспрессию рецептора CD30, относящегося к суперсемейству TNF- рецепторов. Тимоциты, экспрессирующие CD30 становятся чувствительны к действию MDC и мигрируют непосредственно к тельцам Гассаля. Клетки, входящие в состав телец Гассаля и единичные эпителиоциты мозгового вещества продуцируют большие количества CD30L. Взаимодействие CD30L\CD30 индуцирует апоптоз аутореактивных тимоцитов, который и происходит непосредственно возле телец Гассаля [8]. Отметим, что нарушение экспрессии CD30 приводит к развитию аутоиммунных заболеваний. Таким образом, описанный механизм позволяет объяснить наблюдаемые морфологические особенности взаимодействия тимоцитов с тельцами Гассаля.

Однако не все аутореактивные тимоциты погибают, часть из них дифференцируется в Т-регуляторы, клетки, которые эффективно регулируют активность иммунного ответа на периферии и являются дополнительным механизмом поддержания центральной толерантности, так как тельца Гассаля играют важную роль в дифференцировки Т-reg. Тельца Гассаля синтезируют TSLP (тимический стромальный лимфопоэтин) [13]. Этот хемокин вызывает созревание дендритных клеток, ответственных за образование T-регуляторов из высоко- и средне- аутореактивных тимоцитов. Отметим, что антигены Т-регуляторам предоставляются напрямую эпителиальными клетками телец, без межклеточного переноса антигенов и участия дендритных клеток. Таким образом, тельца Гассаля играют главную роль во вторичной позитивной селекции из высоко- и средне- аутореактивных тимоцитов, результатом которой является образование CD4+CD25+ регуляторных T-лимфоцитов в тимусе, которое в большой степени определяет и периферический репертуар Treg в организме. Таким образом, наблюдаемая нами концентрация CD25-положительных клеток возле телец Гассаля также получила полное объяснение.

Хемокин Mig [9] также синтезируется клетками телец Гассаля, но привлекает другие субпопуляции тимоцитов (зрелые CD8 клетки и NK-клетки). Так как тельца синтезируют IL-7 и ТGF-β, которые стимулируют выживание и пролиферацию зрелых тимоцитов, то их взаимодействие с тельцами может способствовать активации указанных субпопуляций тимоцитов [10]. IGF-1 также демонстрируют высокий уровень экспрессии, который оказывают антиапоптотический эффект на развивающиеся тимоциты [13].

Заключение. Таким образом, при исследовании взаимодействия телец с тимоцитами было выявлены несколько структурных закономерностей взаимодействия телец Гассаля и тимоцитов.

1. Тимоциты принимают незначительное участие в морфогенезе телец Гассаля, редко встречаясь между эпителиальными клетками телец, и, еще реже, в полости телец.

2. Обнаружены ультраструктурные данные, свидетельствующие о тесном взаимодействии эпителиальных клеток телец и тимоцитов.

2. Концентрация CD25+ и CD30+ субпопуляций тимоцитов возле телец Гассаля выше, чем в других отделах мозгового вещества.

2. Наблюдался высокий уровень апоптоза тимоцитов возле телец Гассаля и поглощение апоптотических телец макрофагами.

Следовательно, результаты настоящего исследовании и данные литературы свидетельствуют о том, что тельца Гассаля оказывают разнообразное влияние на развивающиеся тимоциты. Они являются компонентом системы по утилизации аутореактивных клеток, синтезируют хемокины, влияющие на миграцию тимоцитов, осуществляют прямую антигенпрезентацию. Предлагаемый алгоритм взаимодействия клеток в рамках негативной селекции позволяет интерпретировать полученные экспериментальные данные и укладывается в рамки современных представлений о процессах позитивной и негативной селекции в мозговом веществе тимуса человека.

Литература:

1. Беловешкин А.Г., Стельмах И.А. // Участие макрофагов в процессе разрушения телец Гассаля тимуса человека. БГМУ: 90 лет в авангарде медицинской науки и практики: сб. научных трудов, Минск: ГУ РНМБ, 2001, т.1, стр. 88-89.

2. Annunziato Francesco, Paola Romagnani, Lorenzo Cosmi, Chiara Beltrame, Macrophage-Derived Chemokine and EBI1-Ligand Chemokine Attract Human Thymocytes in Different Stage of Development and Are Produced by Distinct Subsets of Medullary Epithelial Cells: Possible Implications for Negative Selection The Journal of Immunology 1, 2000 vol. 165 no. 1 238-246.

3. Bodey B, Bodey B Jr, Siegel SE, Kaiser HE: Novel insights into the function of the thymic Hassall’s bodies. In Vivo 2000 14: 407-418.

4. Borgne Marie Le, Ena Ladi, Ivan Dzhagalov, Paul Herzmark, Ying Fang Liao, Arup K Chakraborty Ellen A Robey The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla Nature Immunology 10, 823 – 830 (2009).

5. Blau J N. A phagocytic function of Hassall’s corpuscles. Nature. 1965; 208:564.

6. Bhatia S K, Tygrett L T, Grabstein K H, Waldschmidt T J. The effect of in vivo IL-7 deprivation on T cell maturation. J Exp Med. 1995; 181: 1399.

7. Douek Daniel C. and Daniel M. Altmann. T-cell apoptosis and differential human leucocyte antigen class II expression in human thymus Immunology. 2000 February; 99(2): 249–256.

8. Romagnani Paola, Francesco Annunziato, Roberto Manetti. High CD30 Ligand Expression by Epithelial Cells and Hassal's Corpuscles in the Medulla of Human Thymus \\ Blood. – 1998 – Vol. 91 No. 9. – рр. 3323-3332.

9. Romagnani Paola, Francesco Annunziato, Elena Lazzeri, Lorenzo Cosmi. The Journal of Immunology \\ Interferon-inducible protein 10, monokine induced by interferon gamma, and interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant are produced by thymic epithelial cells and attract T-cell receptor (TCR) CD8+ single-positive T cells, TCR + T cells, and natural killer-type cells in human thymus. – 2001 – Vol. 168 – рр 2609-2617.

10. He W, Zhang Y, Deng Y, Kabelitz D. Induction of TCR-gamma delta expression on triple-negative (CD3-4-8-) human thymocytes. Comparative analysis of the effects of IL-4 and IL-7. J Immunol. 1995 Apr 15; 154(8):3726-31.

11. Surh CD, Sprent J: T-cell apoptosis detected in situ during positive and negative selection in the thymus. Nature372 :100 –103,1994.

12. Senelar R, Escola MJ, Escola R, Serrou B, Serre A. Relationship between Hassall's corpuscles and thymocytes fate in guinea-pig foetus. Biomedicine. 1976 24(2): 112-22.

13. Watanabe N, Wang YH, Lee HK, Ito T, Wang YH, Cao W, Liu YJ. Hassall's corpuscles instruct dendritic cells to induce CD4+CD25+ regulatory T cells in human thymus Nature. 2005 25;436(7054):1181-5.