Нематоцитное и ростостостимулирующее свойства дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis

В настоящее время в биотехнологии существует проблема создания биологически активного вещества обладающего комплексным действием на растения. Такое вещество должно обладать не только ярковыраженными противопаразитарными свойствами, но и быть экзогенным стимулятором роста, в сверхмалых дозах являющимся мощным биологическим раздражителем, стрессовым фактором, мобилизирующим иммунную систему.

Наибольший интерес в этом отношении представляет спорообразующая кристаллоформная бактерия Bacillus thuringiensis, различные подвиды которой обладают избирательным действием в отношении не только фитопаразитических насекомых, фитогельминов, некоторых микроорганизмов, но и является особо перспективной в качестве потенциального биологического агента для сенсибилизации растений. В отношении двух последних, интересующих нас свойств, в настоящий момент существуют лишь теоретические данные, изучение нематоцидных свойств бактерии проводится лишь за рубежом.

Bacillus thuringiensis - энтомопатогенный аэробный почвенный грамположительный микроорганизм, облаждающий способностью во время споруляции образовывать параспоральные кристаллические включения, которые обладают инсектицидной активностью к чувствительным насекомым. Кристаллы имеют бипирамидальную, кубическую или округлую форму и расположены в спорангии на противоположном по отношению к споре конце клетки [1]. В настоящее время накоплен достаточно большой опыт эффективного использования энтомопатогенов B.thurіngіensіs с различным механизмом действия для контроля численности разных групп насекомых. Споро-кристаллический комплекс B.thurіngіensіs и фитозащитные биопрепараты на их основе предопределяют видовой состав восприимчивых вредоносных насекомых. Для микробиологического контроля вредоносных насекомых в агроценозах наиболее широко и успешно используются препараты на основе трех патовариантов B.thurіngіensіs: Патовар А - подвиды B.thurіngіensіs, кристаллы эндотоксинов которых с наибольшей активностью влияют на чешуекрылых (Lepіdoptera). Продуценты таких биопрепаратов как битоксибациллин, (Bt ssp. thurіngіensіs), дендробациллин (Bt ssp. dendrolіmus), энтобактерин (Bt ssp. gallerіae), лепидоцид, дипел (Bt ssp. kurstakі) и ряд других [2].

Имеются данные о неспецифическом действии дельта-эндотоксина на представителей рода Micrococcus, Bacillus, Streptomyces [3,4], а также различных бактерий рода Bacillus на фитопатогенные грибы [5]. Особенный интерес представляет действие дельта-эндотоксина B.thuringiensis на бактериальные и грибные патогены сельскохозяйственных культур, а также условные патогены человека.

Изучению эффективности и механизма действия B.thurіngіensіs на фитонематод в России уделяется мало внимания, этот вопрос остается открытым, но в зарубежных источниках существуют данные о том, что B.thuringiensis является ингибитором роста и размножения почвенных немательминтов. Охарактеризованы пять штаммов B.thuringiensis, продуцирующие дельта-эндотоксины, токсичные для нематод, B.thuringiensis subsp.кurstaki или дипел не изучен.

В ходе эксперимента было оценено ростостимулирующее действие дельта-эндотоксина B.thuringiensis на некторых представителей семейства бобовые, а также его нематоцидное действие на представителей класса немательминтов рода Turbatrix, разновидность Turbatrix acetiю

По результатам серии экспериментов проводимых на одном из промышленных подвидов продуцента дельта-эндотоксина – B.thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 и направленных на выявление ростостимулирующего действия дельта-эндотоксина В.thuringiensis на фасоль, было выявлено отсутствие прямого влияния на длину стебля проростка. На протяжении всего опыта показатели у растений без обработки и обработанных дельта-эндотоксином практически не различались и выровнялись в последний день измерения. Также опыт показал, что дельта-эндотоксин и «Фитоспорин-М» ингибируют рост корня. Длина корня проростков обработанных раствором дельта-эндотоксина оказалась ниже контрольной на 0,3 см, а раствором фитоспорина почти на 1 см.

Напротив же наземная часть растения показала лучшие результаты в варианте обработанном дэльта-эндотоксином:

1. Длина листа по средней жилке показала разницу с контролем 0,7 см, а с фитоспорином 0,4 см;

2. Обхват стебля проростка составил 117%, по отношению к контролю;

3. Сырая масса проростка (стебель и корень) в варианте, обработанном дельта-эндотоксином составила 126 %, а сырая масса побега 112 % по отношению к контролю.

4. По биохимическим показателям проростки, обработанные дельта-эндотоксином показали лучшие результаты по сравнению с контролем. Хорошо видно увеличение содержания сахара, воды и пероксидазы.

Понятие «рост» охватывает ряд основных и многообразных явлений и процессов: увеличение размеров растений, прибавка в весе и т.д. Стимуляция прорастания растений и перераспределение питательных веществ из эндосперма или семядолей для двудольных растений в другие части проростков на самых ранних этапах онтогенеза сохраняется и позже, что проявляется в увеличении площади наземных органов растения. Одним из наиболее подвижных показателей роста является развитие листовой поверхности. Следовательно, приемы, ускоряющие размеры ассимиляционного аппарата, являются главным средством повышения урожайности. Таким образом, можно сделать о «стимулирующем действии кристаллов дэльта-эндотоксина» на рост и развитие растений.

Полевые опыты также дали положительные результаты. Первый мелкоделяночный опыт ставили на фасоли сорта «Журавушка». Второй полевой опыт ставили на горохе. Уборка урожая показала интересные результаты:

1. Средний вес, а также количество семян в бобе оказался максимальным у образца обработанном дельта-эндотоксином;

2. Урожайность у того же образца составила 110% по отношению к контролю;

3. По биохимическим показателям на первом месте также остаются растения обработанные дельта-эндотоксином. Они опережают контрольные образцы по содержанию витаминов, сахара и воды.

Второй полевой опыт ставили на горохе:

1. По количеству и весу семян в стручке также лидирует вариант обработанный дельта-эндотоксином

2. Растения, обработанные дельта-эндотоксином показали заметное увеличение урожайности, по сравнению с контролем.

Известно, что в случае кратковременного воздействия микробных метаболитов на растение может развиваться системная устойчивость, фенотипически схожая с индуцированной. Системную устойчивость растений способны вызывать как авирулентные фитопатогены, так и непатогенные микроорганизмы. Вероятно, выраженный стимулирующий эффект дельта-эндотоксина на развитие растений связан с его способностью подавлять патогенную микрофлору оказывая иммунизирующее действие.

Параллельно нами проводился опыт на выявление нематоцидных свойств дельта-эндотоксина – B.thuringiensis subsp. kurstaki Z-52. В проводимом исследовании были использованы, в качестве модельных биотестов, представители класса немательминтов рода Turbatrix, разновидность Turbatrix aceti или «уксусная угрица», схожие по своему строению с фитопаразитическими нематодами и являющиеся непатогенными как для растений, так и для человека.

Инфицирование модельных биотестов суспензиями B.thuringiensis определенного титра проводили методом per os в разных концентрациях, включая сублетальные. Количество особей в каждом варианте опыта – 80; контроль стерильная вода и стерильная питательная среда. При внесении токсина в концентрации 0,15 мг/мл в лунку с нематодами на первые сутки происходило замедление движения объектов, под микроскопом были заметны явные нарушения в траектории движения, а так же в положении тела отдельных особей. Так наблюдался паралич хвостовой части тела нематод, скручивание или распрямление тела, вызванное повышенным тонусом продольных мышц. За тем наступало прекращение питания и смерть.

По результатам исследований была выявлена не только ингибирующая активность токсина, но и его нематоцидные свойства. Ниже представлена таблица по результатам исследований.

Действие B.thuringiensis susp. kurstaki Z-52 на Уксусную угрицу

Эффективность воздействия препарата зависит от возраста особей в лунке микробиологического планшета: концентрация 0,035 эффективнее для молодых особей на 3 % чем для взрослых; концентрация 0,075 эффективнее для молодняка на 5%; концентрация 0,15 эффективнее для молодняка на 15%; концентрация 0,3 эффективнее для молодняка на 30%; концентрация 0,6 эффективнее для молодняка на 40%; концентрация 1,2 эффективнее для молодняка на 50%, таким образом, препарат оказался эффективнее для молодняка, для каждой концентрации значения отдельные.

Проведенные исследования позволяют сделать следующие выводы:

Дельта-эндотоксин B.thuringiensis, несмотря на ингибирование длины растений и длины корня, оказывает ростостимулирующее действие на растение, как в лабораторных (увеличение площади поверхности листьев, увеличение наземной массы растения, увеличение обхвата стебля, увеличение содержания сахара, воды и пероксидазы), так и в полевых опытах (повышение урожайности, увеличение средней массы бобов, увеличение количества бобов в стручках, повышение содержания витаминов, сахара).

А также было выявлено, что дельта-эндотоксин оказывает нематоцидное действие на Turbatrix aceti. При этом было выявлено, что дельта-эндотоксин более эффективен для молодняка. Это может быть связано с тем, что для молодняка нужна гораздо меньшая концентрация, чем для взрослых особей.

Литература:

1. Wei J.-Z., Hale K., Carta L., Platzner E., Wong C., Fang S.-C., Aroian R.V. Bacillus thuringiensis crystal proteins that target nematode// PNAS.- 2003.- Vol. 100, №5.- P. 2760—2765.

2. Патыка Т.И., Патыка Н.В., Патыка В.Ф. Энтомоцидная и ларвицидная активность Bacillus thuringiensis // Научный вестник Ужгородского университета. Серия Биология.– 2009. – Выпуск 25

3. Юдина Т. Г., Бурцева Л.И. Действие дельта-эндотоксина четырех подвидов Bacillus thuringiensis на различных прокариот //Микробиология. – 1997. – Т.66. - №1. – С.25-31

4. Юдина Т.Г., Милько Е.С., Егоров Н.С. Чувствительность диссоциантов Microccus luteus к действию дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis // Микробиология, 196. – Т.65. – Вып.3. – С. 365-369

5. Смирнов О.В. Патотипы Bacillus thuringiensis и экологические основы их использования в защите растений. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. Санкт-Петербург – Пушкин, 2000, 42 с.