Ключевые слова: высокоэффективная жидкостная хроматография, разработка методики ВЭЖХ, гетероциклические соединения, 1,2,4-триазины, пиразоло [5,1-c] [1,2,4]триазин.
Широкое использование высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в научной и промышленной среде для разделения, обнаружения, количественного и качественного анализа соединений, а так же физико-химического исследования свойств различных классов веществ, в настоящее время является одним из наиболее перспективных методов в различных областях химических и биологических наук. Основой хроматографического разделения является участие различных компонентов разделяемой смеси (как сложной, так и простой) в системе межмолекулярных Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий на границе раздела фаз. ВЭЖХ, как особый способ анализа сложных исследуемых объектов, входит в состав группы методов, которые используют предварительное разделение исходной многокомпонентной смеси на относительно простые вещества [1].
Принцип хроматографического разделения, разработанный русским ученым М. С. Цветом в 1903 году, основан на способности различных веществ специфически адсорбироваться на сорбенте, заключенном в хроматографической колонке, под действием правильно выбранной по составу подвижной фазы − элюента. В современной хроматографии принцип разделения по-прежнему идентичный. В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие по составу элюенты, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Те, в свою очередь определяются детекторами в различных диапазонах длин волн и выводятся на монитор в виде пиков, соответствующих каждому из отдельных веществ. Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование наиболее высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3–5 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно, затрачивая совсем не большое количество времени анализа от 3 до 30 минут [2].
Высокоэффективная жидкостная хроматография — является одним из самых информативных аналитических методов. Этот метод широко используется во всех развитых странах, но в сравнении с другими физико-химическими методами анализа, требует весьма высокой квалификации персонала, а стоимость одного анализа достигает нескольких десятков и даже сотен долларов США. Таким образом, упрощение самой процедуры хроматографического анализа и снижение его стоимости предоставляется важной задачей, а разработка оптимальных параметров хроматографированя, включая создание метода и условий для идентификации и обнаружения, вновь синтезированных веществ, является актуальной задачей.
Чаще всего, специалист в области хроматографии, который занимается разработкой методики ВЭЖХ для обнаружения и анализа особого класса веществ, сталкивается с определенными трудностями. Обуславливается это выбором оптимальных параметров хроматографической системы и условий элюирования. Таким образом, в основу создания методики ВЭЖХ входит: выбор детектора, правильной ВЭЖХ колонки и ее формата, выбор подвижной фазы — растворителя и буфера, режима элюирования, а так же применение валидации, для определения воспроизводимости разработанной методики.
При разработке методики ВЭЖХ наиболее удобна и применима структура оформления методов хроматографии по рекомендациям CIPAC/4105/R, сочетающая в себе простоту оформления и информационную насыщенность [3].
Данная структура представлена следующим образом:
- Область применения методики. Структурные формулы целевых веществ.
- Краткое описание методики. Приготовление стандартных растворов.
- Химические реагенты и материалы.
- Оборудование и условия хроматографирования. Общий вид хроматограммы.
- Критерии пригодности хроматографической системы.
- Требования к параметрам пика(ов) для проведения количественного определения. Проведение количественного определения.
- Основные валидационные характеристики. Рекомендации по проведению валидации.
- Ссылки на нормативные документы и литературные источники.
В нашей работе данная структура оформления методики используется не в полном объеме. Связано это с отсутствием углубленных данных, которые находятся в стадии расчета.
Структура оформления методики очень удобна для химика-аналитика, которому необходимо эту методику воспроизвести [4].
Цели и задачи исследования
Главной целью исследования является разработка оптимальных параметров и условий идентификации гетероциклических соединений, а именно замещенных 1,2,4–триазинов методом ВЭЖХ, а так же хроматогрфическое исследование синтезированного органического соединения 7-амино-3-трет-бутилпиразоло [5,1-c] [1,2,4]триазин-4(6H)-она (2) и создание методики определения с применением ОФ-ВЭЖХ-УФ системы.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- необходимо произвести сбор информации о веществе и о методе исследования, а так же более подробно изучить литературные данные;
- провести ряд дополнительных и вспомогательных исследований данного вещества, а именно ИК-спектрометрию и Уф-спектроскопию;
- провести ряд экспериментальных исследований направленных на разработку оптимальных параметров и условий идентификации вещества методом ВЭЖХ.
Гетероциклические соединения — самая распространенная группа органических соединений, содержащих в своем цикле не только атомы углерода, но и атомы других элементов (гетероатомы). Гетероциклические соединения играют важнейшую роль в процессах метаболизма, а так же обладают высокой биологической активностью. Большая часть современных лекарственных веществ содержит в своей структуре гетероциклы. Они входят в состав многих веществ природного происхождения, таких как нуклеиновые кислоты, хлорофилл, гемоглобин крови, алкалоиды, пенициллины, многие витамины, гербициды и пестициды, гормональные препараты др.
Экспериментальная часть исследования
Исследуемое нами вещество относится к конденсированным гетероциклическим соединениям состоящее из триазинового и пиразольного колец (рисунок 1).
Рис.1. Исследуемое вещество. Структурная формула 7-амино-3-трет-бутилпиразоло [5,1-c] [1,2,4]триазин-4(6H)-он
Представленное на рисунке 1 гетероциклическое соединение было получено синтезом из 7-амино-3-трет-бутил-4-оксо-6Н-пиразоло [5,1-c] [1,2,4]триазин-8- карбоновой кислоты (1) (рисунок 2) [5].
Рис.2. Синтез 7-амино-3-трет-бутилпиразоло [5,1-c] [1,2,4]триазин-4(6H)-она
Полученный пиразоло [5,1-c] [1,2,4]триазин (2) представляет собой светло-розовый кристаллический порошок с молекулярной массой 207.21 г/моль, Tпл.>300°С. Элюент для хроматографии имеет состав: хлороформ 75 %: метанол 25 %.
В результате исследований были сняты спектры полученного вещества в УФ и ИК областях. Для УФ-спектроскопии использовали спектрофотометр фирмы SHIMADZU UV-1800. Были определены оптическая плотность и длина волны детектирования в пределах 190–400 нм. В УФ-спектре соединения (2) наблюдаются 3 максимума поглощения при 210 нм, 251 нм, 322 нм (рисунок 3).
Рис.3. УФ-спектр, полученный при исследовании 7-амино-3-трет-бутилпиразоло [5,1-c] [1,2,4]триазин-4(6H)-она
Для снятия ИК-спектров использовали ИК-Фурье спектрометр фирмы Agilent Technologies Cary 600 Series FTIR Spectrometer. В ИК-спектре пиразоло [5,1-c] [1,2,4]триазина (2) валентное колебание аминогруппы располагается при 3298 см-1. При 3463 см-1 располагается валентное колебание NH-группы, а при 1668 — валентное колебание карбонильной группы кислоты, при 1625 см-1 — карбонильной группы кольца (рисунок 4).
Рис. 4. ИК-спектры 7-амино-3-трет-бутилпиразоло [5,1-c] [1,2,4]триазин-4(6H)-она
Все полученные данные о веществе позволили разработать наиболее оптимальные условия элюирования и параметры ВЭЖХ-системы.
Экспериментальные исследования проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы Agilent Technologies 1260 infinity с УФ-детектором, а так же с последующей компьютерной обработкой результатов в программе Open LAB ChemStation Workstation Revision C. 01.06 (ENG). Был изучен обращено-фазный вариант метода ВЭЖХ с применением колонки Agilent ZORBAX SB-C18 4.6х150 мм, 5 мкм (PN 883975–902, SN VSCM039110, LN B14031), поскольку колонка зарекомендовала себя ранее как относительно дешевая с улучшенной симметрией выхода пиков. В качестве подвижной фазы использовали смесь хлороформ: метанол, взятые в соотношении 75 %: 25 %.
Скорость потока была взята 1.000 мл/мин. Температура колонки − 40°С. Детектирование проводилось при длине волны 252.4 нм. Объем вводимой пробы — 30 мкл.
Так же, в ходе экспериментальной работы была разработана пооперационная схема технологии и последовательности действий, способствующих созданию методики идентификации исследуемого вещества методом ОФ-ВЭЖХ-УФ (рисунок 5). В начале исследований экспериментальным путем нами был определен растворитель для полученного вещества. Тем самым, был подобран конкретный состав и соотношение подвижной фазы.
Рис. 5. Пооперационная схема технологии проведения эксперимента, способствующего созданию методики идентификации исследуемого вещества методом ОФ-ВЭЖХ-УФ
Для градуировки ВЭЖХ-системы использовалось чистое синтезированное вещество как внешний стандартный образец. Для приготовления стандартных растворов, навеску вещества в количестве 0.05 грамм помещали в колбу на 50 мл и доводили метанолом до метки. Полученный основной раствор с концентрацией 1.000 мкг/см3 использовали для приготовления рабочих растворов с концентрациями 0.1 мкг/см3, 0.01 мкг/см3, 0.001 мг/см3, 0.0001мкг/см3.
Перед калибровкой, вводили пробу с наибольшей концентрацией, для точно определения времени удерживания и идентификации вещества.
Калибровку, непосредственно начинали с меньшей концентрации. Вводимую пробу пропускали через мембранный фильтр.
Градуировка прибора проводилась по стандартной схеме, используя методы и знания хроматографического анализа.
Хроматограммы исследуемых калибровочных растворов с разными концентрациями представлены на рисунках 6–10.
Рис. 6. Концентрация раствора 0.0001 мкг/см3
Рис. 7. Концентрация раствора 0.001 мкг/см3
Рис. 8. Концентрация раствора 0.01 мкг/см3
Рис. 9. Концентрация раствора 0.1 мкг/см3
Так же, пятой точкой для идентификации вещества послужила наибольшая концентрация основного раствора равная 1 мкг/см3. Необходимо было с точностью определить отсутствие, каких-либо второстепенных пиков системы или примесей растворителя (метанола) при большой концентрации раствора.
Рис. 10. Концентрация раствора 1.0 мкг/см3
Специфичность методики
При проведении исследования установлено, что время удерживания 7-амино-3-трет-бутилпиразоло [5,1-c] [1,2,4]триазин-4(6H)-она с концентрацией 1 мкг/см3составляет 1.411 мин (рисунок 11). На общей хроматограмме видно, что вещество идентифицировалось как индивидуальное, и пики примесей из растворителя не мешают его определению.
Рис. 11. Общая хроматограмма 7-амино-3-трет-бутилпиразоло [5,1-c] [1,2,4]триазин-4(6H)-она
Линейность методики исследовали на 4 уровнях концентрации (рисунок 12) от теоретического содержания 7-амино-3-трет-бутилпиразоло [5,1-c] [1,2,4]триазин-4(6H)-она
Калибровочный график представлен в виде прямой линии с коэффициентом корреляции 0.99894 и практически равным 1, построенный по 4м точкам.
Рис. 12. Линейность методики определения 7-амино-3-трет-бутилпиразоло [5,1-c] [1,2,4]триазин-4(6H)-она
Возможно, в дальнейшем, данный методический подход может оказаться полезным при постановке методик анализа других веществ с аналогичными структурами и свойствами.
Более подробное изучение всех критериев, факторов и параметров находится в стадии разработки, которые в дальнейшем будут оформлены как индивидуальная методика по рекомендациям CIPAC/4105/R.
Выводы
Предложен метод ВЭЖХ для идентификации замещенных 1.2.4-триазинов. Разработаны параметры хроматографической системы и условия элюирования, заключенные в методику определения веществ методом ВЭЖХ сходных по структуре и свойствам с 7-амино-3-трет-бутилпиразоло [5,1-c] [1,2,4]триазин-4(6H)-он.
Литература:
1. Шаповалова Е. Н., Пирогов А. В. Хроматографические методы анализа: Методическое пособие для специального курса. — Москва: Московский Государственный Университет имени М. В. Ломоносова, 2007. — 203 с.
2. Бидлиншейер Б. Препаративная жидкостная хроматография / Под ред. Бидлиншейера Б., пер. с англ. — Москва: 1990
3. CIPAC/4105/R. Guidelines for the Design of Chromatographic Analytical Methods Intended for CIPAC Collaborative Study.
4. Сычев К. Оформление методик высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в соответствии с международными рекомендациями: Журнал «Аналитика»/ ИП Фирма «СКАН». — 2012. — С 60–66.
5. Mironovich L. M., Podolʼnikova A.Yu. Synthesis and Reactivity of 7-amino-3-tert-butylpirazolo [5,1-c] [1,2,4]triazin-4(6H)-one / Journal of General Chemistry, Vol.84., № 12. — 2014. — C.2064–2066
