Исследование природы полисахаридов синтезируемых микрофлорой оборотных вод бумажных предприятий

Ключевые слова: слизеобразование, леван, бумажная промышленность, бактерии.

Key words: slime control ,enzymes, levan, paper industry, bacteria.

Загрязнение производственных потоков целлюлозно-бумажных предприятий бактериальной и грибной микрофлорой служит причиной перебоев в работе бумагоделательных машин. Оборотные воды производственных потоков содержат большое количество органических (сахара, органические кислоты, спирты, белки) и минеральных веществ, которые служат благоприятной питательной средой для роста микроорганизмов формирующих слизь полисахаридной природы [1]. Температурные условия 30-40ºС и условия рН 5.0-5.5 также являтся благоприятными для роста микробов.

Образующаяся в процессе роста микроорганизмов слизь засоряет производственные потоки, вызывает обрывы бумажного полотна, снижает качество бумаги и производительность оборудования, увеличивает расход тепла и и энергии.

Природа микробных полисахаридов оборотных вод исследована недостаточно. Имеются данные, что одним из таких полисахаридов является леван – β-2,6-фруктозан [2]. Слизистая масса включает в себя микроорганизмы, волокна целлюлозы, древесины и другие частицы, которые образуют сгустки склеенные полисахаридами [2].

На некоторых предприятиях для предотвращения слизеобразования до сих пор используются биоциды, и это наносит соответствующий вред экологии. На многих предприятиях для этого используются ферментные препараты.

Целью настоящих исследований было изучение структуры полисахаридов, синтезируемых микроорганизмами в оборотных водах бумажных машин на примере Кондопожского целлюлозно-бумажного комбината. Установление природы полисахаридов может иметь практическую ценность для разработки новых, более эффективных ферментных препаратов использумых в промышленности для разрушения слизи.

Методы

Объектами осследования служили культуры микроорганизмов выделенных на Кондопожском ЦБК. Оразцы для выделения микроорганизмов отбирали в летнее время со стенок бассейна оборотной воды одной из бумагоделательных машин. Выделенные из образцов слизи микроорганизмы были идентифицированы, как Bacillus cereus, Staphylococcus saprophyticus, Micrococcus luteus. Для выделения полисахаридов бактерии выращивали на жидкой среде следующего состава (г/л): сахароза – 30.0; дрожжевой экстракт – 2.0; KH₂PO₄ – 10.0; (NH₄)HPO₄ – 1.0; pH 5.9-6.0 [3]. Температура культивирования - 37ºС соответствовала оптимуму роста. В качестве посевного материала использовали бактерии выращенные на агаризованной среде того же состава. Для выделения полисахаридов использовали культуры в стационарной фазе роста. Культуральную жидкость центрифугировали при 18000 об/мин в течение 30 мин для отделения клеток. Супернатант депротеинизировали, для этого к нему добавляли 1/25 часть (по объему) бутанола и 1/5 часть хлороформа и затем встряхивали в течение 30 мин на качалке. Водную фазу отделяли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин и использовали для анализа [4].

От низкомолекулярных примесей растворы полисахаридов очищали диализом в дистиллированной воде в течение двух суток [5]. Полисахарид осаждали из раствора 3-4 объемами этанола и отделяли цетрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин [3].

Качественный анализ моносахаридов проводилиметодами тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [6]. Для анализа полисахариды гидролизовали в 0.2 н растворе соляной кислоты при температуре 100ºС в течение 30 мин [3].

Раствор нейтрализовали NaHCO₃ и хроматографировали в током слое на пластинках Силикагель 60F₂₅₄ (Merk) c толщиной слоя 0.25 мм. Разделение моносахаров проводили в двух системах растворителей [7]:

1. н-бутанол – этанол – вода (10:1:2)

2. н-бутанол – уксусная кислота – диэтиловый эфир – вода (9:6:3:1)

Хроматограммы проявляли нафторезорцином [7].

Разделение моносахаров после гидролиза полисахаридов проводили методом ВЭЖХ [6] на жидкостном хроматографе Waters 2690 (Waters, США), укомплектованном рефрактометрическим детектором PL-ELS 1000 (Polymer Laboratories, США) и колонкой Supelcosil LC-NH2 5 micron 4.6x250 мм, (Supelco, США).

Элюентом служила подвижная фаза ацетонитрил/вода (80:20) из двух отдельных емкостей при скорости потока 1.0 мл/мин, объем инжекции 10 мкл. Стандартные растворы сахаров – глюкозы, фруктозы, мальтозы готовили в концентрации 0,1 – 10,0 мг/мл.

Количественное определение фруктозы проводили на фотоэлектроколориметре КФК 2 по известной методике с резорцином [7].

Результаты и обсуждение

С помощью тонкослойной хроматографии были проверены гидролизаты полисахаридов полученных из трех выделеных на Кондопожском ЦБК микроорганизмов – B. cereus, S. saprophyticus, M. luteus , а также образец слизи взятый на комбинате и обработанный по описанной выше методике, как и остальные образцы. Все четыре пробы имели хроматографическую подвижность (R_f) равную 0.35, которая совпадала с R_f контроьного раствора D-(-)-фруктозы и не содержали глюкозы или других сахаров.

ВЭЖХ анализ всех четырех проб показал один пик фруктозы со временем удерживания 6.8 мин, корое совпадало с временем удердивания стандарта D-(-)-фруктозы. Времена удерживания пиков стандартов - глюкозы и мальтозы, взятых для сравнения были 7.7 и 12.9 мин соответственно и эти пики отсутствовали в контрольных четырех образцах.

Из результатов количественного анализа (с резорцином) фруктозы полученной из трех исследованных штаммов бактерий (Таблица 1) видно, что основным продуцентом фруктозы является B. cereus, который возможно и является основным слизеобразователем на Кондопожском ЦБК.

Таблица 1

Концентрация фруктозы из полисахаридов продуцируемых бактериями выделенными на Кондопожском ЦБК

Уже в 1983 году в бумажной промышленности использовались ферментные преператы для устранения слезеобразования [2,8]. Было установлено, что основным компонентом слизи является леван – особый вид фруктозного полимера (β-2,6-фруктозан со связями 2→6 в основной цепи и 2→1 в разветвлениях), который продуцируется на бумажных фабриках бактерией Aerobacter levanicum [9]. Нами эта бактерия не была обнаружена в оборотных водах.

Из литературы известно, что бактерии из рода Bacillus способны продуцировать леван, виды Bacillus subtilis, Bacillus mesetericus, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus vulgaris были описаны, как продуценты левана [8,10,11,12,13]. В литературе не встречается упоминаний об образовании левана бактериями S. saprophyticus и M. Luteus.

В настоящее время ферментные препараты широко используются в бумажной промышленности, но подробная информация о применяемых ферментах обычно не доступна, мало сведений о том, что эти фементы разрушают именно леван и в большинстве случаев речь идет о разрушении триглицеридов [14].

Точное установление состава полисахаридов образуемых бактериями на бумажных предприятиях имеет практическое значение для разработки высокоспецифичных и высокоэффективных ферментных препаратов разрушающих слизь на промышленных предприятиях.

Литература:

1. Блинов Н.П. Основы биотехнологии. Для студентов институтов;аспирантов и практических работников. - СПб: Наука, 1995.-600 с.

2. Hatcher H.I. Ensymit biologisessa liman torjunnassa. // Paperi ja puu. – 1983. N 8. P. 464-465.

3. Элисашвили В.И. Биосинтез левана уксуснокислыми бактериями, выделенными из природных источников. // Прикл. биохим. микробиол. – 1982. Т. 18. № 2. С. 180-185.

4. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. – Киев: Наукова думка, 1982. - 201 с.

5. Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М.: Изд-во МГУ, 1995. - 222 с.

6. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Химия, 1986. – 288 с.

7. Юркевич В.В. Малый практикум по биохимии. М.: Изд-во МГУ, 1979. - 209 с.

8. Hatcher H.I. Enzymatic control of biological deposits in papermarking. // Biotech. Adv. 1984. V.2. N 2. P. 300-317.

9. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987. - 283 с.

10. Chambert R., Petit-Glatron M.F. Polymerase and hydrolase activities of Bacillus subtilis levansucrase can be separately modulated by site-directed mutagenesis. // Biochem. J. 1991. V.279. N 1. P. 35–41.

11. Lammens W., Le Roy K., Schroeven L. et al. Structural insights into glycoside hydrolase family 32 and 68 enzymes: functional implications. // J. Exp. Bot. 2009. V.60. N 3. P. 727–740.

12. Strube, C.P., Homann, A., Gamer, M., et al. Polysaccharide synthesis of the levansucrase SACB from Bacillus megaterium is controlled by distinct surface motifs. // J. Biol. Chem. 2011. V.286. P. 17593-17600.

13. Паршиков И.А., Васичкина Н.И., Симонова Л.Н., Большова Н.И. Устранение слизеобразования при производстве бумаги. Литературный обзор. Целлюлоза, бумага, картон. М.: ВНИПИЭИЛеспром, 1986. № 7. – 32 с.

14. Blanco A., Negro C., Borch K. et al. Pitch control in thermomechanical pulping and papermaking by enzymatic treatments. // Appita J. 2005. V.58. N 5. P. 358-361.