Классическая микробиологическая и масс-спектрометрическая идентификация молочнокислых бактерий, выделенных из квашеной капусты



Целью данного исследования было выделение и идентификация молочнокислых бактерий из квашеной капусты для пополнения коллекционного фонда.

В результате проведенного исследования выделено 13 штаммов, которые первоначально идентифицировали классическими микробиологическими методами. Исследуемые штаммы отнесены к роду Lactobacillus на основе их морфологических и культуральных свойств. Определена родовая и видовая принадлежность штаммов методом MALDI-TOF MS (масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией с использованием матрицы).

Все выделенные молочнокислые бактерии проанализированы на устойчивость к антибиотикам из соображений безопасности. Отобранные штаммы добавлены в коллекционный фонд лаборатории и будут дополнительно проанализированы для оценки технологических свойств.

Ключевые слова: квашеная капуста, молочнокислые бактерии, Lactobacillus, идентификация, MALDI-TOF MS.

Введение

Овощи выступают источником пищевых волокон, минералов и водорастворимых витаминов (B; C), а также фитостеролов. Чаще всего свежие овощи имеют короткий срок хранения и с легкостью подвергаются заражению микроорганизмами, которые приводят к порче. Для ее предотвращения применяют технологию ферментации, которая позволяет продлить срок годности, повысить безопасность и улучшить вкусовые качества овощей. Такой эффект достигается благодаря присутствию в продукте микробного сообщества.

Квашеная капуста — один из примеров ферментированного овоща, представляет собой продукт молочнокислого брожения капусты с добавлением соли, различных специй, а также моркови, клюквы, брусники и яблок.

Ферментация (брожение) — это биотехнологический процесс, в котором основными участниками выступают микроорганизмы, преобразующие сложные субстраты в более простые соединения в условиях отсутствия кислорода.

При получении квашеной капусты происходит молочнокислое брожение с участием молочнокислых бактерий (МКБ). Штаммы молочнокислых бактерий, наиболее часто выделяемые из свежих, ферментированных фруктов и овощей, относятся как к гетероферментативным, так и к гомоферментативным видам Leuconostoc , Weisella , Pediococcus , Lactobacillus , с особенно высокой распространенностью встречается Lactobacillus plantarum [14, 17, 18].

Особый кисловатый вкус квашеной капусте придает молочная кислота, которая образуется в результате молочнокислого брожения. Необходимыми условиями для данного вида брожения являются наличие микроорганизмов, способных перерабатывать углеводы в молочную кислоту, отсутствие кислорода. Способность ферментировать лактозу — уникальное биологическое свойство молочнокислых бактерий, благодаря которому они активно используются в молочной промышленности в виде искусственно созданных микробных консорциумов (бактериальных заквасочных композиций) при производстве кисломолочных продуктов [13].

Для создания композиций бактериальных заквасок отбираются из различных источников молочнокислые бактерии с технологически ценными свойствами. Источниками молочнокислых бактерий могут быть квашеные овощи, самоквасные и сыровяленые продукты. Правильное производство сыра, йогурта и других кисломолочных продуктов зависит от бактериальной заквасочной композиции, вносимой в молоко после пастеризации. Однако, молочная промышленность, вероятно, является той отраслью, в которой документально зафиксировали больше всего проблем с фагами [6].

Бактериофаги (фаги) — вирусы, поражающие бактериальные клетки [12]. Уайтхед (Whitehead H.) и Кокс (Cox G.) [19] были первыми учеными, которые описали пагубное воздействие фаговой инфекции на молочную ферментацию, и, несмотря на огромный научный и технологический прогресс за последние 70 лет, фаги остаются самой крупной и единственной причиной нарушения ферментации в молочной промышленности. В наиболее тяжелых случаях фаговая инфекция может привести к полной потере активности закваски, что приведет к мертвым чанам и утилизации большого количества частично подкисленного молока [12].

Необходимо постоянно пополнять коллекционный фонд штаммов МКБ, чтобы разрабатывать новые заквасочные композиции и обеспечивать молочную промышленность альтернативными культурами с другим фаготипом. В связи с актуальностью данной проблемы целью нашего исследования было выделение молочнокислых бактерий из квашеной капусты и отбор штаммов с потенциалом использования в качестве бактериальной закваски для производства кисломолочных продуктов.

Материалы и методы исследования

1. Источник выделения

Молочнокислых бактерий выделяли из квашеной капусты, приобретенной в продуктовом магазине. Состав продукта: капуста квашеная (капуста свежая, соль пищевая), морковь столовая свежая, клюква.

2. Среда и реагенты

Для серийных разведений использовали 0,85 %-ый физиологический раствор. В качестве питательной среды была использована среда MRS (De Man, Rogosa and Sharpe), состоящая из пептона, дрожжевого экстракта, глюкозы, tween-80, дикалия гидрофосфата, натрия ацетата, триаммония цитрата, магния сульфата, марганца сульфата, растворенных в дистиллированной воде pH (6,2±0,1) [20]. Для метода Грама применяли карболовый раствор генцианвиолета, раствор Люголя, раствор фуксина Циля, 96 %-ый раствор этилового спирта. Для определения каталазной активности использовали 3 %-ый раствор перекиси водорода.

3. Инокуляция и инкубация молочнокислых бактерий

Микроорганизмы выделяли непосредственно из ферментационного сока, отошедшего естественным образом от капусты. Для исследования отобрали 1 см ³ сока капусты, приготовили серийные десятичные разведения в стерильном 0,85 %-ом физиологическом растворе и инокулировали по 0,1 см ³ поверхностным способом на агаризованную среду MRS. Инкубировали при температуре (37±1) ˚C в течение 48 ч. Далее выбирали репрезентативные колонии, представляющие максимальное разнообразие с точки зрения морфологии, для получения чистых культур. Чистую культуру получали посевом штрихом на агаризованную среду MRS. Затем полученные чистые культуры инкубировали в бульоне MRS при температуре (37±1) ˚C в течение 48 ч.

4. Идентификация

У полученных изолятов определяли морфологические и культуральные свойства. На основании проведенных анализов можно сделать вывод о принадлежности молочнокислых бактерий к определенному роду. Предположения подтвердить с помощью метода MALDI-TOF mass spectrometry.

4.1 Определение морфологических свойств

Для определения отношения микроорганизмов к окраске по Граму приготовили мазки путем нанесения суспензии микроорганизмов бактериологической петлей на предметное стекло. Далее мазок высушили на воздухе и зафиксировали. Поместили на мазок полоску фильтровальной бумаги и нанесли 3 капли карболового раствора генцианвиолета, выдержали около 3-х минут. Затем слили краску, убрали фильтровальную бумагу и сполоснули мазок дистиллированной водой в течение 30 секунд. Далее нанесли на мазок 3 капли раствора Люголя, выдержали около 2-х минут, смыли раствор дистиллированной водой в течение 10 секунд. Промыли мазок 96 %-ым раствором этилового спирта до его обесцвечивания (около 60 секунд). Затем сполоснули мазок дистиллированной водой в течение 2-х минут. Нанесли на мазок 3 капли раствора фуксина Циля на 2 минуты. Промыли предметное стекло дистиллированной водой в течение 1 минуты, высушили. Для приготовления мазка использовали культуру, не достигшую 24-часового возраста.

И приготовили препарат методом раздавленной капли для изучения подвижности бактерий.

Морфологию окрашенных по Граму клеток и их форму регистрировали с иммерсией с помощью микроскопа Nikon Eclipse Е200F.

4.2 Определение культуральных свойств

Зафиксировали рост молочнокислых бактерий на жидкой питательной среде, а также определили форму и цвет колоний, выросших на агаризованной среде.

4.3 Определение каталазной активности

Тест на выработку фермента каталазы проводили путем нанесения одной капли 3 %-ого раствора перекиси водорода на бактериальную колонию, взятую с поверхности агаризованной среды и помещенную на предметное стекло.

4.4 Идентификация методом MALDI-TOF mass spectrometry

Определение родовой и видовой принадлежности микроорганизмов, выделенных из квашеной капусты, проводили методом MALDI-TOF MS (масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией с использованием матрицы).

Для подготовки бактерий к анализу необходимо одну клеточную колонию, выращенную на агаризованной среде, нанести на металлическую пластину-мишень. Поверх клеток нанести матричный раствор (обычно α-Циано-4-Гидроксикоричная кислота). Микробная идентификация достигается путем поиска в базах данных, содержащих масс-спектры пептидов и белков, выделенных из представляющих интерес микроорганизмов, с использованием алгоритмов подсчета для сопоставления анализируемых спектров с эталонными спектрами [8].

5. Тест на чувствительность к антибиотикам

Все выделенные молочнокислые бактерии были проанализированы на устойчивость к антибиотикам из соображений безопасности в отношении угрозы антибиотикорезистентности у бактерий.

Тест на чувствительность к антибиотикам проводили диско-диффузионным методом путем измерения зоны ингибирования по отношению к стрептомицину — S (10 мкг), тетрациклину — TE (30 мкг) и пенициллину G — P (10 ЕД).

Суспензии для анализа готовили из 24-часовых культур бактериальных штаммов, выращенных в бульоне MRS при температуре (37±1) ˚C. Оптическую плотность устанавливали равной 0,5 по шкале МакФарланда, что соответствует 1,5  10 ⁸ КОЕ/см ³ . Далее по 1 см ³ каждого изолята внесли на поверхность чашки Петри с питательной средой MRS и равномерно распределили по поверхности. Аппликацию дисков проводили стерильным пинцетом. Образцы инкубировали при (37±1) ˚C в течение 48 часов. Анализ проводили в трех параллельных повторах.

Через 48 ч для каждого штамма определили зоны ингибирования. Исследуемые штаммы подразделяют на устойчивые — R (≤ 14 мм), умеренно устойчивые — I (15–19 мм), чувствительные — S (≥ 20 мм) на основании полученных диаметров зон подавления роста микроорганизмов вокруг диска с антибиотиком.

Результаты исследования

Было отчетливо получено 13 чистых штаммов молочнокислых бактерий (промаркированы от 1 до 13).

Первоначально идентификация изолятов молочнокислых бактерий была проведена классическими микробиологическими методами. Результаты микроскопии клеточных препаратов показали, что выделенные молочнокислые бактерии из квашеной капусты имеют форму палочек, являются неподвижными, при окрашивании по методу Грама приобретают фиолетовый окрас. Метод окрашивания по Граму используется для дифференциации двух больших групп бактерий относительно строения их клеточной стенки на грамположительные и грамотрицательные, которые окрашиваются в фиолетовый или красный цвет соответственно. Те бактерии, которые удерживают первичный комплекс йодного красителя и остаются фиолетовыми, были охарактеризованы как грамположительные, а те, которые обесцвечиваются и впоследствии приобретают контрастное окрашивание (розовый либо красный), были охарактеризованы как грамотрицательные. Морфологические свойства описаны в таблице 1.

Таблица 1

Идентификационные морфологические признаки исследуемых штаммов

Исследуемый штамм	Морфологические свойства
	Форма клеток	Метод Грама	Подвижность
1	палочки	грамположительный	отсутствует
2	палочки	грамположительный	отсутствует
3	палочки	грамположительный	отсутствует
4	палочки	грамположительный	отсутствует
5	палочки	грамположительный	отсутствует
6	палочки	грамположительный	отсутствует
7	палочки	грамположительный	отсутствует
8	палочки	грамположительный	отсутствует
9	палочки	грамположительный	отсутствует
10	палочки	грамположительный	отсутствует
11	палочки	грамположительный	отсутствует
12	палочки	грамположительный	отсутствует
13	палочки	грамположительный	отсутствует

Колонии бактерий, выращенные на среде MRS, имели схожие характеристики. Было замечено, что изоляты образуют беловатые либо бесцветные круглые колонии, типичные для рода Lactobacillus .

На жидкой питательной среде (бульон MRS) большинство штаммов давали равномерный рост, что характерно для факультативных анаэробных микроорганизмов. Культуральные свойства всех выделенных штаммов описаны в таблице 2.

Таблица 2

Идентификационные культуральные признаки исследуемых штаммов

Исследуемый штамм	Культуральные свойства
	Рост на жидкой среде	Форма колоний	Цвет колоний
1	с равномерным помутнением	круглая с ровными краями	бесцветный
2	с равномерным помутнением	круглая с неровными краями	молочно-белый
3	с равномерным помутнением	круглая с неровными краями	молочно-белый
4	с равномерным помутнением	круглая с неровными краями	бесцветный
5	помутнение среды, осадок	круглая с ровными краями	бесцветный
6	с равномерным помутнением	круглая с неровными краями	бесцветный
7	помутнение среды, осадок	круглая с неровными краями	бесцветный
8	с равномерным помутнением	круглая с неровными краями	молочно-белый
9	с равномерным помутнением	круглая с неровными краями	молочно-белый
10	с равномерным помутнением	круглая с ровными краями	бесцветный
11	помутнение среды, осадок	круглая с неровными краями	молочно-белый
12	с равномерным помутнением	круглая с неровными краями	бесцветный
13	помутнение среды, осадок	круглая с неровными краями	молочно-белый

Тестируемые бактерии не могли продуцировать фермент каталазу, как показал тест, и были определены как каталазоотрицательные. Каталазоположительными считаются микроорганизмы, у которых наблюдалось при проведении анализа образование пузырьков. Отсутствие пузырьков (отсутствие фермента каталазы для гидролиза перекиси водорода) представляет собой каталазоотрицательную реакцию. Исследуемые штаммы отнесли к роду Lactobacillus на основе их морфологических и культуральных свойств.

Однако, многим видам молочнокислых бактерий характерна фенотипическая изменчивость под влиянием различных факторов. Штаммы рода Lactobacillus прихотливы [7], форма/размер клеток (палочковидные, кокковидно-палочкообразные, изогнутые, нитевидные или спиральные) широко варьирует у разных видов или при разных условиях культивирования [2, 7, 10]. Поэтому есть необходимость в дополнительной идентификации исследуемых штаммов.

Метод MALDI-TOF MS подтвердил предположения о принадлежности выделенных штаммов к роду Lactobacillus и позволил определить вид бактерий. В таблице 3 представлены результаты масс-спектрометрической идентификации штаммов. Результаты интерпретировали по показателю Score (значение менее 1,7 — сомнительная идентификация; значение 1,7–2,0 — идентификация надежная для определения родовой принадлежности; значение равной 2,0 и более — идентификация надежная для определения вида).

Таблица 3

Результаты масс-спектрометрической идентификации исследуемых штаммов

Исследуемый штамм	Идентифицированный микроорганизм методом MALDI-TOF MS	Показатель Score идентифицируемого штамма	Результат
1	Lactobacillus sakei	1,907	идентификация надежная для определения рода
2	Lactobacillus plantarum	2,229	идентификация надежная для определения вида
3	Lactobacillus plantarum	1,829	идентификация надежная для определения рода
4	Lactobacillus brevis	1,933	идентификация надежная для определения рода
5	Lactobacillus sakei	2,277	идентификация надежная для определения вида
6	Lactobacillus brevis	2,063	идентификация надежная для определения вида
7	Lactobacillus brevis	1,739	идентификация надежная для определения рода
8	Lactobacillus plantarum	2,189	идентификация надежная для определения вида
9	Lactobacillus plantarum	1,838	идентификация надежная для определения рода
10	Lactobacillus sakei	2,500	идентификация надежная для определения вида
11	Lactobacillus plantarum	2,109	идентификация надежная для определения вида
12	Lactobacillus brevis	1,722	идентификация надежная для определения рода
13	Lactobacillus plantarum	1,859	идентификация надежная для определения рода

Потребление жизнеспособных бактерий в виде пробиотиков и функциональных продуктов питания широко используется для улучшения баланса и активности полезной микрофлоры кишечника, что имеет профилактическое значение [15]. Тесный контакт с нативной микробиотой в кишечнике человека является прекрасной предпосылкой для горизонтального переноса генов устойчивости к противомикробным препаратам с помощью мобильных генетических элементов [16]. Отсутствие переносимой резистентности к терапевтическим антибиотикам является важным критерием выбора подходящего функционального штамма [4]. Поэтому определили чувствительность всех исследуемых штаммов к трем антибиотикам (тетрациклин, стрептомицин, пенициллин G), имеющих значение для человека. Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты определения чувствительности к антибиотикам

Исследуемый штамм	Идентифицированный микроорганизм методом MALDI-TOF MS	Чувствительность к антибиотикам
		TE (30 мкг )	S (10 мкг )	P (10 ЕД )
1	Lactobacillus sakei	S	R	I
2	Lactobacillus plantarum	S	R	I
3	Lactobacillus plantarum	S	R	I
4	Lactobacillus brevis	S	I	R
5	Lactobacillus sakei	S	I	R
6	Lactobacillus brevis	S	I	R
7	Lactobacillus brevis	S	I	R
8	Lactobacillus plantarum	S	R	R
9	Lactobacillus plantarum	S	R	R
10	Lactobacillus sakei	S	I	I
11	Lactobacillus plantarum	S	I	R
12	Lactobacillus brevis	S	I	R
13	Lactobacillus plantarum	S	I	R

Было замечено, что все штаммы от 1 до 13 были чувствительны к тетрациклину. Этот результат соответствует выводам Георгиева (Georgieva T.) и др. [5], которые показали, что у бактерий рода Lactobacillus наблюдается чувствительность к тетрациклину.

У некоторых штаммов зафиксирована умеренная (у 61 % штаммов) или полная устойчивость (39 %) к стрептомицину. Устойчивость к антибиотику грамотрицательного спектра (стрептомицину) часто наблюдается у рода Lactobacillus [1, 3, 9].

У ряда штаммов определена умеренная (у 31 % штаммов) и полная устойчивость (69 %) к пенициллину G. В исследовании Шалини (Mathur S.) и Сингха (Singh) [11] у некоторых штаммов также наблюдалась устойчивость к пенициллину G.

Заключение

Из квашеной капусты выделено 13 штаммов. Они определены как грамположительные, неподвижные, каталазоотрицательные палочки рода Lactobacillus . Отобранные изоляты были проанализированы на устойчивость к антибиотикам для понимания их безопасности.

Выделенные штаммы внесены в коллекционный фонд лаборатории и будут дополнительно изучаться на наличие производственно-ценных свойств.

Литература:

1. Ammor, M. S., Flórez, A. B., van Hoek, A. H. A. M., de los Reyes-Gavilán, C. G., Aarts, H. J. M., Margolles, A., & Mayo, B. (2007). Molecular Characterization of Intrinsic and Acquired Antibiotic Resistance in Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 14(1–3), 6–15. doi:10.1159/000106077
2. Beck, W. S., Hook, S., & Barnett, B. H. (1962). The metabolic functions of vitamin B12. Biochimica et Biophysica Acta, 55(4), 455–469. doi:10.1016/0006–3002(62)90978–2
3. Danielsen, M., & Wind, A. (2003). Susceptibility of Lactobacillus spp. to antimicrobial agents. International Journal of Food Microbiology, 82(1), 1–11. doi:10.1016/s0168–1605(02)00254–4
4. EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP); Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance. EFSA Journal 2012;10(6):2740. [10 pp.] doi:10.2903/j.efsa.2012.2740.
5. Georgieva, R., Yocheva, L., Tserovska, L., Zhelezova, G., Stefanova, N., Atanasova, A., Karaivanova, E. (2014). Antimicrobial activity and antibiotic susceptibility ofLactobacillusandBifidobacteriumspp. intended for use as starter and probiotic cultures. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 29(1), 84–91. doi:10.1080/13102818.2014.987450
6. Garneau, J. E., & Moineau, S. (2011). Bacteriophages of lactic acid bacteria and their impact on milk fermentations. Microbial Cell Factories, 10(Suppl 1), S20. doi:10.1186/1475–2859–10-s1-s20
7. Hammes, W. P., & Hertel, C. (2006). The Genera Lactobacillus and Carnobacterium. The Prokaryotes, 320–403. doi:10.1007/0–387–30744–3_10
8. Jang, K.-S., & Kim, Y. H. (2018). Rapid and robust MALDI-TOF MS techniques for microbial identification: a brief overview of their diverse applications. Journal of Microbiology, 56(4), 209–216. doi:10.1007/s12275–018–7457–0
9. Klare, I., Konstabel, C., Werner, G., Huys, G., Vankerckhoven, V., Kahlmeter, G., Goossens, H. (2007). Antimicrobial susceptibilities of Lactobacillus, Pediococcus and Lactococcus human isolates and cultures intended for probiotic or nutritional use. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 59(5), 900–912. doi:10.1093/jac/dkm035
10. Klaenhammer T. R. Microbiological considerations in selection and preparation of Lactobacillus strains for use as dietary adjuncts. J Dairy Sci 1982; 65: 1339–1349.
11. Mathur, S., & Singh, R. (2005). Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria — a review. International Journal of Food Microbiology, 105(3), 281–295. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2005.03
12. Mc Grath, S., Fitzgerald, G. F., & van Sinderen, D. (2007). Bacteriophages in dairy products: Pros and cons. Biotechnology Journal, 2(4), 450–455. doi:10.1002/biot.200600227
13. Orlova T. N., Dorofeev R.V, Irkitova A. N., Funk I. A., Grebenshchikova A. V. (2019). Biological feature of lactic acid bacteria in distinct ecological niches. Ukrainian Journal of Ecology, 9 (3), 384–388.
14. Szutowska, J. (2020). Functional properties of lactic acid bacteria in fermented fruit and vegetable juices: a systematic literature review. European Food Research and Technology. doi:10.1007/s00217–019–03425–7
15. Saarela, M., Lähteenmäki, L., Crittenden, R., Salminen, S., & Mattila-Sandholm, T. (2002). Gut bacteria and health foods—the European perspective. International Journal of Food Microbiology, 78(1–2), 99–117. doi:10.1016/s0168–1605(02)00235–0
16. Teuber, M., Meile, L., & Schwarz, F. (1999). Antonie van Leeuwenhoek, 76(1/4), 115–137. doi:10.1023/a:1002035622988
17. Torres S, S., Verón, H., Contreras, L., & Isla, M. I. (2020). An overview of plant-autochthonous microorganisms and fermented vegetable foods. Food Science and Human Wellness. doi:10.1016/j.fshw.2020.02.006
18. Viridiana, C.-R., Lidia, D.-A., Audry, P.-L., & Humberto, H.-S. (2018). Lactic Acid Bacteria Isolated From Vegetable Fermentations: Probiotic Characteristics. Reference Module in Food Science. doi:10.1016/b978–0–08–100596–5.22601–2
19. Whitehead, H. R., Cox, G. A., The occurrence of bacteriophages in starter cultures of lactic streptococci. N. Z. J. Sci. Technol. 1935, 16, 319–320.
20. Галынкин В. А. Питательные среды для микробиологического контроля качества лекарственных средств и пищевых продуктов: Справочник / В. А. Галынкин и др. — СПб: Проспект Науки, 2017. — 336 с.