Исследование факторов, влияющих на стабильность жирнокислотного состава некоторых видов микроорганизмов, поддерживаемых в коллекциях

Изучены качественные и количественные особенности жирнокислотного состава некоторых представителей грамположительных и грамотрицательных бактерий, которые подвергались воздействию замораживания-высушивания. При помощи метода газовой хроматографии выявил наличие у них насыщенных, ненасыщенных жирных кислот и оксикислот с длиной цепи от 12 до 19 углеродных атомов.

Установлено, что на концентрацию жирных кислот микроорганизмов наиболее значительное влияние оказывали температурные факторы, включая условия культивирования и последующее хранение лиофилизированных образцов.

Ключевые слова: микроорганизмы, жирные кислоты, хроматография.

Введение

Большинство методов оценки стабильности лиофилизированных микроорганизмов базируются на определении концентрации живых клеток, расчетах коэффициента выживаемости клеток и динамики гибели клеток с прогнозом предельных сроков их хранения. Относительно небольшим остается удельный вес работ, посвященных изучению постоянства оболочечного комплекса обезвоженных клеток, что важно для правильного выбора качественного и количественного состава защитных сред и понимания молекулярных механизмов инактивации, обратимого восстановления жизненных функций.

Клеточные липиды — одни из многочисленных молекулярных признаков микроорганизмов, которые применяются при изучении их разнообразия. Анализ биоматериала по содержанию жирных кислот дает информацию о родовом и видовом составе присутствующих в нем микроорганизмах. Применительно к лиофилизированным объектам такие исследования нам неизвестны.

Целью работы было изучение условий подготовки бактериальных клеток к высушиванию, температуры, собственно замораживания-высушивания и последующего хранения на качественные и количественные показатели их жирнокислотного (ЖК) состава с использованием методов газовой хроматографии — масс спектрометрии.

Материалы и методы

Микроорганизмы. Исследовали грамположительные (Гр+) и грамотрицательные (Гр-) бактерии из коллекционных штаммов «ГКПМ-Оболенск» ГНЦ ПМБ, представленных видами Bacillus lentus, B.firmus, B.subtilis, B.cereus, B.thuringiensis, Paenibacillus polymyxa, B.anthraces (вакцинный штамм), B.coagulans, Enterococcus faecium, E.faecalis, Listeria monocytogenes, L.inocula, Yersinia pestis (вакцинный штамм) и Escherichia coli.

Питательные среды и условия культивирования. Штаммы бацилл, энтерококков, листерий, эшерихий выращивали на ГРМ-агаре с некоторыми вариациями по составу при 30° С в течение суток. Для сбора микроорганизмов с агаризованной среды в чашку Петри вносили по 5 мл стерильного физраствора и с помощью шпателя Дригальского переводили выросшую биомассу во взвесь, которую затем собирали в стеклянные флаконы с помощью пипетки. Защитные среды сознательно не использовали, так как содержащиеся в них протекторы искажали бы картину исследований ЖК-состава микроорганизмов.

Условия замораживания-высушивания. Флаконы с микроорганизмами замораживали до температуры -50°С в течение 3 часов и затем высушивали в лиофилизаторе Virtis BT-4k (США) в течение 18–22 ч. После высыхания проб флаконы закрывали резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками. Одни из них закладывали на хранение, другие исследовали сразу.

Хроматографическое определения жирных кислот.

Пробоподготовка образцов включала переэтерификацию липидов — их перевода из глицеридов, фосфолипидов, свободных ЖК и т. д. в единообразную форму метиловых эфиров высших жирных кислот. Полученные эфиры разделяли на газохроматографической колонке и количественно определяли методом внутреннего стандарта [1–3]. Для этого в сосудики отбирали точную навеску высушенной биомассы (от 5,0 до 30,0 мг), к ней прибавляли по 100 мкл внутреннего стандарта — раствора гептадекановой кислоты в сухом метаноле (200–300 мкг/мл). После туда же вносили по 200 мкл 0,5 М раствора едкого натра в сухом метаноле и 50 мкл бензола, плотно завинчивали крышку, помещали в ячейку настольного термостата «Мультиблок», нагретого до 70° С, и выдерживали 20 мин для сапонификации глицеридов и фосфолипидов. Для полного метилирования свободных жирных кислот в смесь в конце добавляли по 1,0 мл 15 % метанольного раствора трехфтористого бора с экспозицией при температуре 80°С в течение 1 часа. Сосудики с реагентами охлаждали, вносили в них по 1,0 мл н-гексана и 1,0 мл дистиллированной воды, интенсивно встряхивали содержимое и оставляли до полного расслоения гексановой и водно-спиртовой фаз. Для хроматографического анализа использовали органическую фазу, содержащую метиловые эфиры бактериальных жирных кислот и внутренний стандарт.

Хроматографирование проводили в кварцевой капиллярной колонке СУПЕЛКОВАКС-100, 12 м х 0,2 мм х 0,2 мкм аналитического газового хроматографа ВАРИАН 3900; газ носитель — гелий (1,2 мл/мин). Режим ввода и анализа проб: объем — 2 мкл; температурная программа — от 100°С (задержка 1 мин) до 240°С (задержка 10 мин); температуры испарителя и детектора — 260°С и 250°С; тип детектора — пламенно-ионизационный, регистрация сигнала — компьютерная программа «Мультихром-1,5х».

Идентификация пиков и определение жирных кислот. В указанных выше условиях регистрировали хроматограммы экспериментального образца и стандартной смеси бактериальных жирных кислот «СУПЕЛКО»; в хроматограмме экспериментального образца идентифицировали хроматографические пики конкретных жирных кислот по их временам удерживания. В тех редких случаях, когда хроматограмма содержит отсутствующие в калибровочной смеси «СУПЕЛКО» пики (например, относящиеся к полиненасыщенным кислотами С20-С22), использовали искусственные калибровочные смеси, составленные из индивидуальных компонентов. В остальных случаях применяли метод внутреннего стандарта (в каждую пробу вводится 20–30 мкг гептадекановой кислоты). Для кислот С10-С14 калибровочный коэффициент — 0,85; для кислот С16-С18 — близок к 1,00; для кислот С20 — к 1,20; для кислот С22 — к 1,45.

Для определения групповых калибровочных коэффициентов хроматографировали смесь, содержащую известные концентрации кислот 14:0, 17:0 (стандарт), 18:0, 20:0, 22:0. Калибровочный коэффициент индивидуальной кислоты Х по 17:0 находили по формуле:

К_x = С_хS_ст /C_ст S_х, где:

С_x-концентрация определяемой кислоты Х,

S_ст — площадь пика стандарта 17:0,

C_cт — концентрация стандарта 17:0,

S_х — площадь пика определяемой кислоты Х.

Определение относительного (процентного) содержания каждой конкретной жирной кислоты в исследуемой биомассе выполняли по формуле:

С_х = 100K_xS_xm_cт/S_ст m_обр, где:

K_x — калибровочный коэффициент кислоты Х по внутреннему стандарту (17:0),

S_x — площадь пика определяемой кислоты X,

m_cт — масса введенного в пробу стандарта (17:0-кислоты), мкг

S_ст — площадь пика стандарта 17:0,

m_обр — масса анализируемого образца биологического материала, мкг.

Кроме того, в целях идентификации биологических объектов часто используют не абсолютные величины концентрации той или иной жирной кислоты в биомассе (или, что то же, ее процентные содержания С_х в образце), а так называемые относительные содержания индивидуальных кислот. Сумма всех жирных кислот образца принимается за 100 %, и для каждой индивидуальной кислоты определяется ее доля в этой сумме.

Данный параметр гораздо менее информативен, однако определяется с несколько большей точностью, нежели абсолютные концентрации индивидуальных кислот в исходном образце. Его определение проводят по формуле:

, где:

 — массовая доля кислоты Х в сумме всех жирных кислот образца,

 — калибровочный коэффициент кислоты Х по 17:0,

 — площадь пика кислоты Х,

 — калибровочный коэффициент i-й кислоты по 17:0,

 — площадь пика i-й кислоты.

В тех случаях, когда в хроматограмме регистрируются только тривиальные жирные кислоты С16-С18, все калибровочные коэффициенты можно считать равными единице, и в этом случае массовая доля жирной кислоты в смеси жирных кислот равна отношению площади пика этой кислоты к сумме площадей всех пиков жирных кислот хроматограммы. Минимально определяемое количество конкретной жирной кислоты в описанном выше варианте метода составляет около 0,5 мкг.

Для оценки погрешности определения проводили анализ нескольких параллельно приготовленных образцов каждого из исследуемых биологических материалов, после чего с помощью программы «Microsoft Excel» находили величину среднего значения и среднего квадратичного отклонения.

Результаты исследований

Результаты проведенных исследований по изучение условий подготовки бактериальных клеток к высушиванию, температуры, собственно замораживания-высушивания и последующего хранения на качественные и количественные показатели их жирнокислотного (ЖК) состава с использованием методов газовой хроматографии представлены в табл. 1–5.

Таблица 1

Зависимость ЖК состава от рода и вида микроорганизмов

Как следует из данных табл. 1, у грамположительных бактерий, общее количество ЖК оказалось выше, чем у грамотрицательных бактерий (E.coli и Y.pestis). Исключение составили лишь представители рода листерий.

Даже среди штаммов одного вида существуют некоторые отличия по индивидуальным жирным кислотам, что видно из данных табл. 2. Вместе с тем, несомненно, что у штаммов E.faecium имеется специфический и ни на что не похожий состав: необычно присутствие тридекановой ЖК (13:0), стабильно наличие циклопропановых кислот, соотношение четных и нечетных кислот, но отсутствуют линолевая и линоленовая кислоты. Все это позволяет достаточно надежно отличать этот вид бактерий от других — например, в пробах биологических жидкостей. Из анализа данных табл. 2 также следует, что суммарное содержание липидов больше суммы жирных кислот, поскольку включает неидентифицированные минорные их компоненты.

Таблица 2

Сравнение штаммов E.faecium по составу жирных кислот

Жирная кислота*	Штаммы E.faecium и концентрация жирных кислот, вес. %
	33.22	4Ф	5Ф	6Ф
12:0	0,0082	-	-	-
13:0	0,0484	0,0241	0,0322	0,0304
14:0	0,0204	0,0125	0,0129	0,0027
15:0	0,0027	0,0013	0,0016	-
16:1	0,0217	0,0423	0,0346	0,0047
16:0	0,0917	0,0219	0,0315	0,0094
Δ 17:0	0,0349	-	-	-
18:1	0,0325	0,0633	0,0475	0,0068
18:0	0,0027	0,0012	0,0235	0,0173
18:2	-	-	-	-
18:3	-	-	-	-
Δ 19:0	0,0126	0,0030	0,0064	0,0002
Сумма, вес. %	0,32	0,19	0,24	0,12
16:1/16:0	0,237	1,931	1,098	0,500
18:1/18:0	12,0	52,8	2,021	0,393
13:0/16:0	0,53	1,10	1,02	0,393
(*) 12:0 –лауриновая, 13:0 — тридекановая, 14:0 — миристиновая, 15:0 — пентадекановая, 16:0 –пальмитиновая, 16:1 — пальмитолеиновая, 17:0 — маргариновая, 18:0 — стеариновая, 18:1 — олеиновая, 18:2 — линолевая, 18:3 — линоленовая, 19:0 — нанодекановая

При исследовании влияния температуры культивирования бактерий на количественный состав жирных кислот было установлено, что если у вакцинного штамма чумного микроба психрофильные условия способствуют некоторому увеличению общей жирности оболочечного комплекса клеток по сравнению с мезофильными, то у грамположительных представителей, B.thuringiensis и L.inocula — наоборот (табл. 3).

Таблица 3

Зависимость ЖК состава микроорганизмов от температуры выращивания

На ЖК-состав заметное влияние оказывал и состав питательной среды для культивирования бактерий. Это видно на примере сравнения двух образцов одного штамма B.lentus: один из них выращивали с добавлением дрожжевого экстракта (ДЭ), другой — кукурузного экстракта (КЭ). Так, из данных табл. 4 следует, что если в присутствии дрожжевого экстракта процентное содержание лауриновой, миристиновой, пальмитиновой и пальмитолеиновой кислот было в 2–3 раза выше, то олеиновой и линолевой — в 7–10 раз ниже, чем в среде с кукурузным экстрактом.

Таблица 4

Влияние источника витаминов в среде роста на жирнокислотный состав поверхностного комплекса клеток штамма B. lentusПС-1

Источник витаминов в среде	Содержание индивидуальных жирных кислот*, %										Общая жирность, %
	12:0	14:0	14:03	14:02	16:0	16:1	18:0	18:10	18:2	18:3г
ДЭ**	44,5	0,81	2,1	8,1	4,8	0,82	0,32	0,25	0,19	0,14	6,2
КЭ***	10,6	0,35	0,5	1,3	3,9	0,25	0,49	1,8	1,8	0,04	2,1
(*) 12:0 –лауриновая, 14:0 — миристиновая и ее производные, 16:0 –пальмитиновая, 16:1 — пальмитолеиновая, 18:0 — стеариновая, 18:1о — олеиновая, 18:2 — линолевая, 18:3г — γ-линоленовая. (**) дрожжевой экстракт, (***) кукурузный экстракт.

Из результатов сравнительных исследований двух лиофилизированных образцов клеток штамма E.coli М17 следует, что тепловое воздействие на клетки в результате хранения при температуре 25–30 °С в течение года приводит к снижению как суммарного, так и индивидуального количества жирных кислот в среднем на 32 % (табл. 4). При этом величина взятого на анализ образца (в пределах 5–10 мг) существенного влияния на конечный результат не оказывает.

Таблица 5

Сравнение жирнокислотного состава двух лиофилизированных образцов E.coli

Наименование и количество обнаруженных кислот в пробах E.coli М17, мг %
Жирная кислота	исходной (контроль)		хранившейся (опыт)
	Нав. 8,7 мг	Нав. 5,6 мг	Нав. 8,3 мг	Нав. 6, 1 мг
12:0 (лауриновая)	51	52	32	33
14:0 (миристиновая)	98	99	62	65
15:0 (пентадекановая)	16	18	13	14
16:0 (пальмитиновая)	425	450	301	293
16:1 (пальмитолеиновая)	140	135	77	81
18:0 (стеариновая)	6,7	8,0	5,0	5,4
18:1 (олеиновая)	161	170	94	87
18:2 (линолевая)	2,3	3,0	2,2	3,1
18:3 (α-линоленовая)	36	42	30	37
Сумма ЖК	1085	1172	736	735

Заключение и выводы

Анализ жирнокислотного состава бактерий выявил наличие насыщенных, ненасыщенных жирных кислот и оксикислот с длиной цепи от 12 до 19 углеродных атомов (табл. 1). Из полученных данных следует, что разнообразие и концентрации индивидуальных кислот могут заметно различаться не только в зависимости от родовой и штаммовой принадлежности бактерий, но и от состава питательных добавок, используемых при их культивировании (табл. 1–4).

Полученные данные о влиянии факторов культивирования, среды обитания и вида микроорганизмов на жирнокислотный состав их оболочечного комплекса согласуются, в целом, с данными литературных источников [1, 4]. Поскольку интерпретация зависимости жирнокислотного состава от условий получения клеток довольно сложная и полученные данные являются предметом дальнейших исследований, в настоящей работе мы ее не приводим, а ограничимся более очевидными выводами.

Выводы

1.        У грамположительных бактерий, общее количество ЖК оказалось выше, чем у грамотрицательных бактерий.

2.        Штаммы E.faecium характеризуются необычным для ряда микроорганизмов присутствием тридекановой кислоты, величинами соотношения четных-нечетных кислот и отсутствем линолевой и линоленовой кислот (табл. 3).

3.        Температура культивирования и состав питательных веществ отражаются на количественном составе липидного комплекса бактерий (табл. 3, 4).

4.        Длительное хранение лиофилизированных клеток бактерий при температуре 25–30 °С  приводит к снижению как суммарного, так и индивидуального количества жирных кислот (табл. 5).

Литература:

1.                  Крымцева Т. А. Минорные жирные кислоты биологических жидкостей урогенитальных органов и их значимость в диагностике воспалительных процессов / Т. А. Крымцева, Г. А. Осипов, Н. Б. Бойко, Я. А. Соколов, A. M. Демина, Т. В. Радюшина, Д. Г. Осипов // Журн. Микробиол. Эпидемиол. Иммун. — 2003. — № 2. — С. 92–101.

2.                  Blondz, I. Development of fatty acid analysis by chromatography and related techniques// Analitica Chimica Acta. — 2002. –Vol. 465. — Р. 1–37.

3.                  Knapp, D. R. Handbook of analytical derivatization reactions. — N.Y.: John Wiley and Sons, Inc, 1979. –154 р.

4.                  Коптева Ж. П. / Моносахаридный и жирнокислотный состав экзополимерного комплекса бактерий-деструкторов защитного покрытия газопровода Ж. П. Коптева, В. В. Занина, М. А. Борецкая, Ю. М. Юмына, А. Е. Коптева, И. А. Козлова // Мікробіол. журн. — 2012.-Т. 74. — № 2. — С. 22–28.