Экспериментально-фармакологическое исследование эффектов растительного полифенола ресвератрола в модели постменопаузального остеопороза



Остеопороз представляет одну из серьезных медицинских и социо-экономических проблем в связи с высокой частотой инвалидизирующих осложнений — низкоэнергетических переломов трубчатых костей и компрессионных переломов тел позвонков, в настоящее время и негативной тенденцией ее роста в ближайшие 10 лет [1]. При этом одной из проблем является небезопасность современных фармакотерапевтических средств при их длительном применении, ведущая к негативному восприятию лечения пациентами [4].

Поэтому сейчас внимание обращено на фармакологически активные агенты естественного растительного происхождения. К ним относится полифенол ресвератрол, известный в традиционной китайской медицине, а в научных исследованиях ставший основным в объяснении так называемого «французского парадокса» [2]. Не смотря на большое количество работ о его фармакологических свойствах,в том числе in vitro исследований влияния на костные элементы [5] актуальность сохраняют in vivo исследования механизмов эффективности данного вещества, как в виде монотерапии остеопороза, так и в комбинации с современными препаратами, что определило цель и задачи данной работы.

Цель исследования: Провести экспериментально-фармакологическое исследование динамики развития остеопоротических изменений проксимального эпифиза бедренной кости и фармакологических эффектов ресвератрола.

Материалы и методы исследования. Исследование выполнено на 20 самках крыс Вистар, содержавшихся в виварии «НИИ фармакологии живых систем» ГИУ БелГУ в стандартных условиях. Использованы животные массой 280–300 г, что соответствует возрасту 6 мес — возрасту скелетной зрелости, рекомендованному для проведения исследований скелетных изменений при экспериментальных воздействиях [6]. Животные рандомизированы на 4 равные группы:

1) ложнооперированные, у которых выполняли лапаротомию без каких-либо воздействий после ушивания брюшной полости;

2) с двусторонней овариоэктомией и наблюдением до 4 недель;

3) с двусторонней овариоэктомией и наблюдением до 8 недель;

4) с двусторонней овариоэктомией с последующим ежедневным внутрибрюшинным введением ресвератрола в дозе 2 мг/кг на физрастворе и наблюдением до 8 недель.

Хирургические вмешательства выполнены под внутрибрюшинным наркозом медитином и золетилом. Выведение животных эксперимента по окончании указанных сроков выполнено путем цервикальной дислокации под внутрибрюшинным хлоралгидратным наркозом.

Перед взятием материала проксимальных эпифизов (головка и шейка) обеих бедренных костей для функциональной оценки на мультифункциональной лабораторной рентгеновской установке IN-VIVO MS FX PRO (Bruker;США) с системой молекулярной визуализации при помощи программного обеспечения — Bone Density Software выполняли денситометрию изучаемых частей костей с оценкой минеральной плотности кости (g/cm3) по показателю BCD (Bone Column Density), характеризующему степень ослабления рентгеновского излучения на единицу глубины материала.

Для гистологического исследования материал фиксировали в 10 % забуференном формалине Histosafe. Костные фрагменты декальцинировали в жидкости «Surgipath DecalcifierII» (Leica, Германия), автоматическим способом заливали в парафин с последующим изготовлением и окраской гистологических срезов толщиной 7 мкм гематоксилином и эозином и по Маллори. Кроме обычной световой микроскопии создавали цифровые аналоги препаратов с помощью системы сканирования и архивирования изображений Hamamatsu, аналитическим модулем NDP. View 2 которой проводили измерение линейных параметров костных структур, изготавливали иллюстрации. Удельные площади костных структур и костномозговых пространств оценивали методом точечного счета по Г. Г. Автандилову.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты гистологического и денситометрического исследований показали, что структурно-функциональные изменения, характеризующие остеопороз и экстраполируемые на патологию у человека, развиваются у экспериментальных животных уже с 4 недель рослее овариоэктомии. В балках губчатого вещества головки и шейки выявлен полный спектр изменений, считающихся патоморфологическими критериями остеопороза. Среди них мы выявили значительное нарушение микроархитектоники костей, увеличение доли костномозговых пространств (30,5+0,1 % против 25,0+0,3 % у ложнооперированных животных; p<0,05), проявления деструкции костного вещества в виде хондроидной дегенерации, пластинчатого расщепления и самого главного критерия — микропереломов костных балок (рис 1).

Рис 1. Структурные изменения в бедренной кости через 8 недель моделирования остеопороза (группа 3): а — трабекулы с очагами хондроидной дегенерации и пластинчатого расслоения, б — лимфо-гистиоцитарный инфильтрат (верхняя стрелка) и типичный активный остеокласт с резорбционной лакуной (нижняя стрелка), в — выраженное гиперпластическое ожирение в шейке (широкая стрелка) и области метафиза (двуконечная стрелка), крупные жировые клетки (диаметр помеченной измерительным отрезком 57,5 мкм). Окр. гематоксилином и эозином. Сканированные препараты

В толще костных балок распространены остеоцитарные изменения. Тела клеток сморщены, гиперхромные, что можно предположить как проявление апоптоза. Отростки отсутствуют или определяются в виде штрихов кнаружи от костных лакун, значительная часть которых запустевшая. О потерях костной массы свидетельствует и достоверное (p<0,05) снижение минеральной плотности до 1,86 + 0,03 g/cm3 в сравнении сложнооперированными животными(3,1 + 0,02 g/cm3). Изменением, которое мы считаем возможным отнести к критериям остеопоротического поражения, явилось обратившее на себя внимание во всех наблюдениях в группах с остеопорозом увеличение доли жирового компонента в костномозговых пространствах. При этом диаметр жировых клеток оказался достоверно (р=0,000002) меньшим (33,5 + 0,8) в сравнении с ним у животных первой группы (39,3 + 0,8), но увеличилось их количество (рис 2).

Рис. 2. Структурные изменения в головке бедренной кости через 8 недель моделирования остеопороза и терапии ресвератролом: а — интактная структура остеоцитов, б –новообразованные костные пластины с цементирующими линиями (стрелка), в — костномозговые пространства со снижением количества жировых клеток, г — митоз(метафаза) в области эндостальной концентрации кость-выстилающих клеток. Окр. гематоксилином и эозином (б,в,г), по Маллори(а). Ув х400(а,г), б,в –сканированные препараты

С учетом известных данных о генезе жировых клеток костного мозга [3], развивающихся из общего с остеобластами источника — стромальных мезенхимальных клеток, данное проявление гиперпластического ожирения может отражать превалирование адипоцитарного коммитирования клеток-предшественников с ущербом для остеобластической дифференцировки и, соответственно, ремоделирования костных структур.

Через 8 недель моделирования эстроген-депривационного остеопороза описанные изменения достигли еще большей выраженности (рис 1). При этом в отличие от срока 4 недели, на котором наблюдались мелкие остеокласты и остеокластоподобные клетки с 2–4 ядрами, преимущественно в местах микропереломов балок, спустя 8 недель обнаруживались типичные остеокласты с резорбционными лакунами, которым сопутствовали лимфо-гистиоцитарные инфильтраты. О прогрессировании костных потерь свидетельствуют также результаты морфометрии трабекул и данные денситометрии. Хотя в сравнении с предыдущей серией уменьшение средней толщины трабекул до 44,1 + 1,2 мкм не имело статистической значимости, в сравнении с ложнооперированными животными оно было значительным (р<0,01).

Минеральная плотность по показателю BCD оказалась несущественно большей (2,58 + 0,2 g/cm3 в сравнении с 4 неделями, но осталась достоверно (р<0,05) ниже в сравнении с ложнооперированными животными. Ожирение костномозговых пространств сохраняло преимущественно гиперпластический характер, так как при значительном увеличении количества адипоцитов их средний диаметр (32,3 + 0,8 мкм) остался меньшим, как в сравнении с таковым как у ложнооперированных животных, так и с 4-недельной серией. Популяция адипоцитов стала гетерогенной с наличием как мелких клеток, так и значительно (в 1,5 раза) превышавших их средний диаметр у ложнооперированных животных.

В серии с терапией ресвератролом ежедневной внутрибрюшинной дозой 2 мг/кг выявлены значимые отличия от серии 4 с моделью остеопороза, свидетельствующие об остеопротекторном и репаративном эффектах препарата (рис 2). Прежде всего, большая часть остеоцитов отличалась сохранной структурой: их тела практически полностью занимали пространства лакун, радиально направленные отростки имели четкие контуры. На предсуществующих эндостальных поверхностях обнаружены новообразованные костные пластины с концентрической ориентацией и разграничением непрерывными цементирующими линиями. Важно, что на этих же поверхностях наблюдалась концентрация овальныхклеток типа кость-выстилающих и более крупных базофильных типа остеобластов, среди которых обнаруживались митотические фигуры.

Изменениям подвергся и жировой компонент костномозговых пространств,что проявилось явным уменьшением количества адипоцитов, средний диаметр которых(32,3+0,8мкм) остался достоверно меньшим в сравнении с ним и у ложнооперированных животных, и с предыдущей серией.

Анализ полученных данных с учетом данных литературы позволяет сделать следующие выводы.

1. Начальные морфо-функциональные изменения в проксимальном эпифизе бедренной кости, соответствующие критериям остепоротического поражения, развиваются уже с 4 недель после билатеральной овариоэктомии. Это дает основания предполагать данный срок как оптимальное время начала исследования фармакологических агентов профилактического назначения или для лечения ранних стадий остеопороза.
2. Фармакотерапевтическая эффективность ресвератрола при экспериментальном постменопаузальном остеопорозе обосновывается коррекцией основных диагностически значимых морфо-функциональных показателей и обеспечивается многонаправленным действием на костное ремоделирование, коммитирование и дифференцировку костномозговых стромальных предшественников, включающим цитопротективное для остеоцитов действие, остеобластическое коммитирование костномозговых предшественников с ингибированием адипоцитарного и активацию эндостального неоостеогенеза.
3. Можно предполагать перспективным исследование и применение ресвератрола в составе комбинированной терапии, в том числе как остеопротектора для нивелирования возможных побочных действий основного препарата.

Литература:

1. Рожинская Л. Я., Луценко А. С. О международном симпозиуме «Актуальные вопросы лечения пациентов с остеопорозом. Остеопороз и остеопатии. 2021. 24(3); 33–34.
2. Васильев Г. В., Новиков О. О., Кочкаров В. И. Фармакологическая характеристика резвератрола / Курский науч.-практ. вест. «Человек и его здоровье». -2007. — № 3. — С. 97 104
3. Arantza Infante and Clara I. Rodríguez Osteogenesis and aging: lessons fromьmesenchymal stem cellsStem Cell Research & Therapy (2018) 9:244 https://doi.org/10.1186/s13287–018–0995-x
4. Camacho P. M. Metabolic bone diseases. A case based approach witzerland.- Springer. 2019; 270 p.
5. Jing Feng, Shuai Liu, Sai Ma, Jian Zhao,Wei Zhang,Wei Qi, Pengchong Cao, ZhengWang3*, andWei Lei Protective effects of resveratrol on postmenopausal osteoporosis: regulation of SIRT1-NF-kB signaling pathway// Acta Biochim Biophys Sin (2014) | Volume 46 | Issue 12 | P 1024–1032
6. Nаsibeh Yousefzadeha, Khosrow Kashfib, Sajad Jeddia et al. Ovariectomized rat model of osteoporosis. A practical guide ////:EXCEL Journal 2020;19:89–107