Использование метода Лоури для количественного определения белка в альбумине | Статья в сборнике международной научной конференции

Библиографическое описание:

Евсельева Е. А., Симонян Е. В., Шумакова Н. А. Использование метода Лоури для количественного определения белка в альбумине [Текст] // Медицина: вызовы сегодняшнего дня: материалы Междунар. науч. конф. (г. Челябинск, июнь 2012 г.). — Челябинск: Два комсомольца, 2012. — С. 90-92. — URL https://moluch.ru/conf/med/archive/52/2379/ (дата обращения: 21.08.2018).

Введение. Альбумин – природный белок, составная часть фракции крови человека, в состав которого входят все 20 незаменимых аминокислот. Растворы альбумина являются эффективным средством коррекции гипоальбуминемии различного генеза, восстановления коллоидно – онкотического давления, нарушенной центральной и периферической гемодинамики, а также как средство дезинтоксикационной терапии при дегидратации и «сгущении» крови.

Для определения концентрации белка существующая нормативная документация рекомендует использовать метод, основанный на способности пептидной связи образовывать комплексы с солями меди в щелочной среде, который обеспечивает высокую чувствительность, однако линейность биуретовой реакции зависит от концентрации ионов Cu2+. При низком содержании ионов двухвалентной меди в среде значительная ошибка наблюдается при определении низких концентраций белка. При высоком содержании ионов Cu2+ необходимо увеличивать pH для их стабилизации, но при значительном увеличении pH проба мутнеет и становится непригодной для анализа уже через 30 мин. Изменение окраски раствора при использовании биуретового реактива пропорционально не столько концентрации белка как таковой, сколько количеству пептидных связей. Метод может давать завышенные результаты в присутствии олигопептидов, которые аналогично белкам реагируют с биуретом. В связи с чем, актуальным остается вопрос разработки альтернативного метода. Проблема определения концентрации белка насчитывает уже более 60 лет. Окончательно она не решена до сих пор. Очевидно, что создание "идеального метода" неосуществимо в силу уникальности структуры каждого белка.

Метод Лоури обладает высокой чувствительностью (10-60 мг/л), но интенсивность окраски пропорциональна не концентрации общего белка, а количеству тирозина и триптофана. Содержание этих аминокислот в различных белках различно. Так, в альбуминах и γ-глобулинах оно различается более чем на 20%. Поэтому метод Лоури широкого применения в медико-биологической практике не нашел, хотя при определении концентрации индивидуальных белков он – один из лучших.

Целью настоящего исследования является разработка способа количественного определения белка методом Лоури и валидационная оценка метода.

Объектом исследования был раствор альбумина 10%, производимый на Челябинской станции переливания крови [2]. В качестве стандартного образца использовали стандартный образец предприятия (СОП) альбумина с концентрацией 9,98%. Содержание белка в СОПе определяли по эталону методом Къельдаля. (Эталон стандартизирован и предоставлен Центральной лабораторией государственного контроля и изучения качества препаратов крови, кровезаменителей и консервирующих растворов).

Определение проводили по методике ГФ XII издания без предварительного осаждения белка [3]. Было установлено, что продукт взаимодействия альбумина с реактивом Фолина характеризуется максимумами светопоглощения при 330±2, 345±2 и 750±2 нм (рис. 1).

Рис. 1

При построении калибровочных графиков использовали раствор стандартного образца. Для этого в мерную колбу вместимостью 25 мл вносили, соответственно, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 … 1 мл раствора СОП альбумина, прибавляли по 5 мл реактива Фолина, доводили водой до метки, выдерживали 30 минут и измеряли оптическую плотность полученных растворов в максимумах светопоглощения. Было установлено, что в интервале концентраций 0,04 – 0,2% наблюдается линейная зависимость в максимумах светопоглощения при 345±2 и 750±2 нм.

Критерием приемлемости линейности является коэффициент корреляции, величина которого должна быть не ниже 0,99. Полученные данные полностью соответствуют данному критерию. Было установлено, что значения коэффициента корреляции наиболее достоверно при использовании в качестве аналитической длины волны 750 нм (R2= 0,9921). Расчет количественного содержания белка и валидационную оценку метода проводили по стандартному образцу [1]. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты количественного определения белка методом Лоури

Найдено белка, %

Xi - Xср

(Xi - Xср)2

Метрологические характеристики

9.98

- 0.1

0.01

Xср =10.08

10.13

0.05

0.0025

SD = 0.10517

10.14

0.06

0.0036

x±∆x = 10.08±0.1103

9.92

- 0.16

0.0256

RSD = 1.09%

10.18

0.1

0.01

-

10.14

0.06

0.0036

-

Установлено, что метод отличается воспроизводимостью и небольшой погрешностью определения, что дает основание использовать его при количественной оценке белка в лекарственных формах.

Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания белка в растворах, полученных путем добавления определенного количества стандарта к исследуемому раствору. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Определение правильности методики

Содержание альбумина, г/мл

Добавлено СО альбумина, г

Расчетное содержание белка, г

Найденное содержание, мг

Открываемость,

0,004137

2.5

0,2536

0.2528

99.68

0.004137

2.5

0,2536

0.2519

99.32

0.004137

2.5

0,2536

0.2522

99.45

0.004137

5

0,5031

0.4989

99.17

0.004137

5

0.5031

0.4992

99.22

0.004137

5

0.5031

0.5003

99.44

0.004137

7.5

0.7526

0.7498

99.63

0.004137

7.5

0.7526

0.7475

99.32

0.004137

7.5

0.7526

0.7501

99.67

-

-

-

-

99.43


Среднее значение выхода для альбумина составило 99,43 %. Критерий приемлемости – средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, скорректированный на 100 %, и его средняя величина должна находиться в пределах 100±5 %.

Выводы.

      1. Изучена возможность использования цветной реакции с реактивом Фолина для идентификации и количественной оценки белка в альбумине.

      2. Определена линейность и подчиняемость закону Бугера – Ламберта – Бера.

      3. На основании результатов количественного определения белка в различных сериях альбумина проведена статистическая обработка.


Литература:

  1. Александров Ю.И., Беляков В.И. Погрешность и неопределенность результата химического анализа // Журнал аналитической химии. – 2002, Т. 57, № 2. – С. 118-129.

  2. Альбумин 10% раствор для инфузий ФСП ЛС – 001269 – 061011.

  3. Государственная фармакопея Российской Федерации / Издательство «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», 2008. – 704 с.

Основные термины (генерируются автоматически): концентрация белка, стандартный образец, белок методом, правильность методики, оценка метода, RSD, количественное содержание белка, количественная оценка белка, высокая чувствительность, раствор альбумина.

Похожие статьи

Методика количественного определения суммы аминокислот...

Аминокислоты являются структурными компонентами белков и составной частью

Материалы и методы.

Таким образом, разработана методика количественного определения суммы аминокислот в листе каштана конского обыкновенного с использованием спектрофотометрии.

Влияние инсулина на функциональную активность нейтрофилов...

концентрация белка, стандартный образец, белок методом, правильность методики, оценка метода, RSD, количественное содержание белка...

«Методы количественного определения витаминов».

концентрация белка, стандартный образец, белок методом, правильность методики, оценка... Разработка метода ВЭЖХ для идентификации замещенных...

Показатели белков острой фазы воспаления у больных...

Статистическая обработка полученных результатов проводилась методом вариационной статистики с помощью Microsoft Excel.

Анализ содержания белков острой фазы воспаления в плазме периферической крови у больных острыми и подострыми формами бруцеллёза показал...

Биохимические маркеры белок S100 и СРБ в ассоциации...

Проведено исследование содержания белка S100бета в цереброспинальной жидкости и сыворотке крови 25 больных с каротидным ишемическим инсультом. Исследования цереброспинальной жидкости в 1-е сутки инсульта выявили повышение концентрации белка...

Анализ химического состава говядины | Статья в журнале...

Содержание белка в мясе устанавливали методом Лоури в модификации Ластырь (1978). Содержание жира определяли гравиметрическим методом в аппарате Сокслета.

Изучение цитотоксичности биологически активных соединений на...

Кроме выше перечисленных методов довольно часто применяются такие тесты: определение количества жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего; определение содержания общего белка, как показателя прироста клеточной массы...

Взаимосвязь между клинико-биохимическими показателями...

Количественное определение С реактивного белка в сыворотка крови больных воспалительной кардиомиопатией выявило его высокое содержание

Обнаружено, что у больных 2 группы концентрация С реактивного белка достоверно выше, чем у больных 1 группы (р < 0,001).

Исследование влияния ЭМП крайне низких частот на...

Проблема определения концентрации белка насчитывает уже более 60 лет. Содержание этих аминокислот в различных белках различно.

Использование метода Лоури для количественного определения... Растворы альбумина являются эффективным средством...

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle

Похожие статьи

Методика количественного определения суммы аминокислот...

Аминокислоты являются структурными компонентами белков и составной частью

Материалы и методы.

Таким образом, разработана методика количественного определения суммы аминокислот в листе каштана конского обыкновенного с использованием спектрофотометрии.

Влияние инсулина на функциональную активность нейтрофилов...

концентрация белка, стандартный образец, белок методом, правильность методики, оценка метода, RSD, количественное содержание белка...

«Методы количественного определения витаминов».

концентрация белка, стандартный образец, белок методом, правильность методики, оценка... Разработка метода ВЭЖХ для идентификации замещенных...

Показатели белков острой фазы воспаления у больных...

Статистическая обработка полученных результатов проводилась методом вариационной статистики с помощью Microsoft Excel.

Анализ содержания белков острой фазы воспаления в плазме периферической крови у больных острыми и подострыми формами бруцеллёза показал...

Биохимические маркеры белок S100 и СРБ в ассоциации...

Проведено исследование содержания белка S100бета в цереброспинальной жидкости и сыворотке крови 25 больных с каротидным ишемическим инсультом. Исследования цереброспинальной жидкости в 1-е сутки инсульта выявили повышение концентрации белка...

Анализ химического состава говядины | Статья в журнале...

Содержание белка в мясе устанавливали методом Лоури в модификации Ластырь (1978). Содержание жира определяли гравиметрическим методом в аппарате Сокслета.

Изучение цитотоксичности биологически активных соединений на...

Кроме выше перечисленных методов довольно часто применяются такие тесты: определение количества жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего; определение содержания общего белка, как показателя прироста клеточной массы...

Взаимосвязь между клинико-биохимическими показателями...

Количественное определение С реактивного белка в сыворотка крови больных воспалительной кардиомиопатией выявило его высокое содержание

Обнаружено, что у больных 2 группы концентрация С реактивного белка достоверно выше, чем у больных 1 группы (р < 0,001).

Исследование влияния ЭМП крайне низких частот на...

Проблема определения концентрации белка насчитывает уже более 60 лет. Содержание этих аминокислот в различных белках различно.

Использование метода Лоури для количественного определения... Растворы альбумина являются эффективным средством...

Задать вопрос