При культивировании дрожжей в определенном режиме происходит синтез инвертазы и эффективность синтеза фермента строго зависит от питательной среды и условий культивирования. На примере Ркацители-6 [Абдуразакова С. Х., 1990] было показано, что при непрерывно-доливном способе брожения в голодающих условиях при лимитации углеводов и температуры, происходит сверхсинтез некоторых гидролитических ферментов. Эти данные были получены для совершенствования технологии брожения на биокаталитической основе для выбраживания виноградного сусла по белому способу. Результаты нашли своё применение в виноделии для получения экологически чистых и экспортоориентируемых виноматериалов.
Однако, использованная питательная среда — виноградное сусло не может служить питательной средой для целей получения ферментных препаратов в силу её дороговизны. Поэтому, данная работа была посвящена выбору продуцента, оптимальной питательной среды и оптимизации условий культивирования дрожжей для цели получения фермента инвертазы.
Культивирование дрожжей в периодическом процессе было проводилось при 260С в колбах Эрленмейера с объемом 500 мл, содержащей 200 мл питательной среды [Дехканов Д. Б. 2004]. Культивирование дрожжей в непрерывно-доливном процессе проводилось в 5 л реакторе с исходной средой № 4 (1 л) при 60С до бурного накопления биомассы и достижения стационарной фазы роста, затем подключалась система с минимальной или же с исследуемой средой при скорости потока 20 мл/ч.
Активность инвертазы в бродящей среде определяли в два этапа. На первом этапе смешивали 20 мл культуральной жидкости, 10 мл 0,1 М ацетатного буфера (рН 4,0) и 10 мл сахарозы (10 %) и смесь инкубировали в течение 2 ч при 370С. Контролем при определении активности фермента инвертазы служила культуральная жидкость, которая предварительно инактивировали кипячением (с обратным холодильником) в водяной бане в течение 5 мин. Количество образовавшихся сахаров определяли по методу Бертрана [Агабальянц Г., 1968].
В начале работы был проведен отбор активных продуцентов инвертазы. Для скрининга были отобраны три культуры дрожжей Saccharomyces vini, которые очень успешно используются в пищевой промышленности, в частности винодельческой промышленности:
1- Saccharomyces vini Ркацители-6; 2- Saccharomyces vini Ркацители-2; 3- Saccharomyces vini К-96.
Скрининг дрожжей проводили в периодическом режиме при 260С в течении 4 суток сбраживанием сусла по белому способу. Данные представлены на рис.1.
Рис. 1. Скрининг активных продуцентов инвертазы
Показано, что Ркацители-6 проявляет свою наибольшую активность через 72 часа (61,0 Ед) и далее она была отобрана как активный продуцент инвертазы и использована в дальнейших исследованиях.
На следующем этапе работы были протестированы следующие среды для замены виноградного сусла на синтетическую: органические (виноградное сусло) с (среда № 4) и без добавления сахарозы (среда № 3) и искусственные: условно названные среда № 1 [Breierova E., 1994] и среда № 2 [Сhen Y., 1996], в которых глюкоза была заменена на сахарозу (1 %).
Наблюдение за брожением осуществляли по следующим критериям: визуальное сбраживание, количество образовавшейся биомассы, количество белка в культуральной среде и общая инвертазная активность.
Рис. 2. Влияние различных сред на синтез инвертазы
Бурное брожение и активное накопление дрожжевой биомассы наблюдалось через 47 часа роста культуры и причем только в виноградном сусле (cреда № 4). При этом наблюдалось проявление инвертазной активности 32460 Ед при выходе биомассы 800 мг/100 мл (белок в среде составлял 2,5 мг/мл). Из синтетических сред, только в среде № 2 наблюдалась инвертазная активность (15488 Ед).
Для усиления синтеза инвертазы было изучено влияние температуры на эффективность процесса брожения в периодическом режиме. Процесс брожения проводили при 6, 12, и 260С. Полученные результаты представлены на рис. 3.
Из рис.3. видно, что процесс брожения при 260С длился 6 суток, хотя активность фермента проявляется на 3 сутки процесса и максимальная инвертазная активность (61,1 Ед) наблюдается на 4 сутки брожения. Брожение при 120С активность фермента проявилась на 4 сутки и повышалась постепенно до 6 сутки, где её активность составила 31,9 Ед, а при 60С активность появилась в 4 сутки брожении и максимальная активность инвертазы (101,0 Ед) определена на 6 сутки.
Рис. 3. Влияние температуры брожения на синтез инвертазы
Таким образом, оптимальными параметрами культивирование дрожжей Saccharomyces vini для цели получения инвертазы является следующие: результаты скрининга показывают что, штамм Ркацители-6 был эффективен для биосинтеза инвертазы и культивирование дрожжей в непрерывно-доливном режиме в накоплении биомассы в среде № 4 (50 % общего объёма среды) и подключении среды № 2 со скоростью потока 20 мл/ч и проведении брожения при 60С. На 6 сутки процесс останавливается отделением дрожжевой биомассы от культуральной жидкости.
Литература:
1. Абдуразакова С. Х. Совершенствование технологии бродильных производств на основе стимулирования биокаталических процессов // -Ташкент: Фан., 1990. -140 с.
2. Агабальянц Г. Г. Химико-технологический контроль виноделия // –М.: Пищевая промышленность. 1968. — 612 с.
3. Дехканов Д. Б., Мирзарахметова Д. Т., Рахимов М. М. Получение высокоактивной дрожжевой инвертазы // Вестник НУУз. 2004. -№ 3. –С.3–4.
4. Breierova E. Cryoprotection of physiologic yeast species by use of additives with cryoprotective media // Cry Letters. 1994. –V.15. –P.191–197.
5. Chen Y., Krol J., Cino J., Freedman D. Continuous production of Thromodulin from Pichia pastoris fermentation // Journal Chem. Tech. Biotechnol. 1996. –V.67. –P.143–148.
