Разработка комплексного ферментного препарата целлюлолитического действия на основе кофейного жмыха и гриба Aspergillus oryzae



Ферменты — важнейшие органические соединения, которые широко применяются в промышленности. Ферменты — специфические белки, которые в организме выполняют роль катализатора. Синтезируя и расщепляя вещества, сами ферменты не разрушаются. В результате химических реакций они не расходуются и после их окончания остаются в прежнем количестве. Ферментные препараты получают при помощи культивирования организмов-продуцентов.

Важными для современной промышленности являются ферменты целлюлолитического действия. Они крайне широко распространены в современной промышленности: эти ферменты используются текстильной и целлюлозно-бумажной промышленности, производство стиральных порошков и пищевых продуктов, животноводстве и лесоводстве — везде, где необходима обработка целлюлозосодержащих продуктов. Для выращивания ферментов целлюлолитического действия может быть использован гриб Aspergillus Oryzae , который в процессе своей жизнедеятельности образует данные ферменты.

Обычно, средой для получения гриба Aspergillus Oryzae и, как следствие, целлюлолитических ферментов служат следующие вещества: пшеничные отруби, в состав среды также вводятся солодовые ростки, богатые витаминами группы В, клетчаткой, фосфором, аминокислотами и легко усваиваемыми углеводами. Компонентами питательной среды могут быть также рисовая, овсяная или ячменная шелуха, солома, древесные опилки и другие целлюлозосодержащие компоненты.

Кофейный жмых — вещество, богатое целлюлозой и другими биологически активными веществами, необходимыми для роста и развития гриба Aspergillus oryzae , которое теоретически может быть использовано для удешевления процесса производства этого гриба и, как следствие, целлюлолитических ферментов, однако данная среда не находит применения на данный момент.

Цель работы — вырастить гриб Aspergillus oryzae и получить целлюлолитический фермент на специфичной среде — кофейном жмыхе — и проверить активность выделенного фермента.

Задачи:

1. Изучить область применения ферментов целлюлолитического действия
2. Изучить возможность выращивания ферментов целлюлолитического действия на среде из кофейного жмыха
3. Вырастить ферменты целлюлолитического действия и проверить их активность
4. Сделать выводы о роли целлюлолитических ферментов и среде для их выращивания

Общее представление о ферментах целлюлолитического действия

Целлюлолитические ферменты — вещества, которые инициируют гидролиз (т. е.разложение) межмолекулярных гликозидных связей в целлюлозе, в результате чего образуются простые вещества — моносахариды. По принципу действия целлюлолитические ферменты делятся на две группы: эндодеполимеразы и экзодеполимеразы. Первые расщепляют связи внутри полисахаридной цепи, в то время, как экзодеполимеразы действуют путем расщепления связей на концах полисахаридной цепи

К ферментам целлюлитического комплекса можно отнести:

– эндо-1,4-β-глюканазы

– экзо-1,4-β-глюканазы, или целлобиогидролазы

– экзо-1,4-β-глюкозидазы;

– β-глюкозидазы (целлобиазы)

Экзо-1,4-β-глюканазы катализируют гидролиз кристаллической формы целлюлозы, при этом последовательно отщепляя глюкозу от концов полисахаридной цепи, а эндо-1,4-β-глюканазы — гидролиз аморфной формы, расщепляя связи внутри цепи и создавая новые сайты для действия экзо-1,4-β-глюканаз, экзо-1,4-β-глюкозидазы и β-глюкозидазы катализируют гидролиз олигосахаридов до целлобиозы и целлобиозы до глюкозы (рис. 1).

Рис. 1. Расщепление целлюлозы

Гриб Aspergillus oryzae

Аспергилл — род аэробных плесневых грибов, который насчитывает несколько сотен видов. Различные виды этого рода распространены по всему миру. Грибы растут на богатых углеродом средах, преимущественно на средах, содержащих углеводы. Грибы этого рода зачастую растут на продуктах, богатых крахмалом (Хлеб, картофель). В процессе жизнедеятельности они продуцируют ферменты, которые способны расщеплять углеводы. Вегетативное тело гриба — многоклеточный, сильно разветвленный мицелий, обладающий многоядерными клетками.

Ход выполнения работы по синтезу целлюлаз

1. Для начала необходимо простерилизовать среду для выращивания гриба, чтобы в среде не осталось никаких посторонних микроорганизмов. Для этого в несколько чашек петри высыпаем по одинаковому количеству кофейного жмыха (в нашем случае — 5 грамм), и отправляем на 1,5 часа в сухожаровой шкаф. (рис. 2) Вместе со средой отправляем туда же воду в пробирке.

Рис. 2. Кофейный жмых

Рис. 3. Измерение влажности жмыха

2. Отмеряем еще один грамм кофейного жмыха (рис. 3) для определения его влажности (это важно, т. к. оптимальная влажность для роста Aspergillus Oryzae — около 60 %) и отправляем в сухожаровой шкаф на 20 минут для того, чтобы выпарить из него большую часть воды. Через 20 минут взвешиваем его массу и определяем количество испарившейся воды.

В итоге получаем:

До сухожара: m=122,8359 (масса жмыха + массы чашки петри)

После сухожара: m= 122,6569 (масса жмыха + массы чашки петри)

Т. е. масса испарившейся воды составляет 0,179 грамм (18 %)

Тогда для увлажнения 5 грамм жмыха до уровня около 60 % необходимо долить приблизительно 2 грамма воды (берем несколько меньше необходимого, чтобы не переувлажнить среду)

3. Через 2 часа можем считать, что чашки петри со средой и вода в пробирке простерилизовались. Переносим чашки со средой, спиртовку, стерильную воду и пипетку на рабочий стол. Зажигаем спиртовку для создания условно стерильной среды, в которой будем проводить засевание гриба на среду. В пробирку со спорами граба Aspergillus ory zae заливаем стерильную воду. Производим забор воды с помощь пипетки (2 мл) и выливаем в чашку петри со средой. Процедуру проводим со всеми чашками петри. После этого ставим чашки петри в инкубационный шкаф сроком на неделю.
4. Через неделю достаем чашки петри с уже проросшими спорами. Одно из свойств целлюлолитических ферментов заключается в их хорошей растворимости в воде. Заливаем чашки петри небольшим количеством дистиллированной воды и оставляем их на некоторое время. Получаем водный экстракт фермента.
5. Приготовим вещество для проверки активности ферментов. Для этого готовим 1 %-й раствор карбоксиметилцеллюлозы. Для этого на 100 мл воды добавляем 1 грамм порошка и растворяем его. Растворить его при н. у. его сложно, поэтому нагреем его (рис. 4) периодически помешивая его с помощью магнитной мешалки (рис. 5).

Рис. 4. Раствор карбоксиметилцеллюлозы

Рис. 5. Магнитная мешалка

6. Ферменты проявляют наибольшую активность в подкисленной среде, поэтому, предварительно померив pH-среды, добавляем одну каплю 0.1 М серной кислоты. (рис. 6)

Рис 6. Измерение pH-среды

7. Целлюлоза — полисахарид, в растворе представляет собой вязкое вещество. Наберем пипетку (10 мл) раствора карбоксиметилцеллюлозы и измерим время, за которое он вытечет из пипетки. Повторим процедуру несколько раз, фиксируя результат. Получаем среднее время: 25,6 секунд.
8. Наберем воду из чашек петри, в которых находятся грибы и добавим полученный раствор в карбоксиметилцеллюлозу. Подождем некоторое время. По истечение 10 минут измеряем время спуска 10 мл полученного раствора, получая среднее время — 8,5 секунд. (Табл. 1) Время уменьшилось в результате разрушения целлюлозы целлюлотическим ферментом (целлюлазой). Целлюлоза расщепилась до моносахаридов — глюкозы, став более текучей. Таким образом, с помощью Aspergillus oryzae , выращенном на среде из кофейного жмыха можно получить целлюлазы

Таблица 1

Контрольное время спуска

№	Время спуска без ферментов	Время спуска с ферментом
1	25,77	8,94
2	25,62	8,83
3	25,00	8,84
4	26,26	8,00
5	25,68	8,12
	Среднее: 25,666 секунд	Среднее: 8,546 секунд

Вывод

В ходе работы над проектом было установлено, что ферменты целлюлолитического действия крайне важны для современной промышленности и используются в самых различных её областях. Свойства, присущие данным ферментам, исследуются и область применения данных ферментов стремительно расширяется.

В ходе проведения работы было доказано, что эти ферменты могут быть продуцированы грибом Aspergillus oryzae, а этот гриб, в свою очередь, может произрастать на среде из кофейного жмыха. Убедиться, что ферменты, полученные нами — целлюлазы нам помог раствор карбоксиметилцеллюлозы: до введения данных ферментов он имел тягучую консистенцию, а после введения данного фермента — его консистенция изменилась — превратилась в более жидкую. Это свидетельствует о том, что целлюлоза, входящая в состав карбоксиметилцеллюлозы расщепилась до мономеров — молекул глюкозы.

Таким образом, можно сказать, что гипотеза, озвученная ранее подтвердилась. Гриб Aspergillus oryzae можно вырастить на среде из кофейного жмыха и таким образом можно получить целлюлазы.

Литература:

1. Величко Б. А. и др. Способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов целлюлолитических ферментов. — 1984.
2. Карелин А. А., Цветков Ю. Е., Нифантьев Н. Э. Синтез олигосахаридов, родственных полисахаридам клеточной стенки грибов Candida и Aspergillus //Успехи химии. — 2017. — Т. 86. — №. 11. — С. 1073–1126.
3. Кривова А. Ю. и др. Биотехнологические аспекты целевого использования Aspergillus oryzae в пищевых технологиях //Вопросы питания. — 2018. — Т. 87. — №. 5 приложение. — С. 218–219.
4. Лобанок А. Г., Бабицкая В. Г., Богдановская Ж. Н. Микробный синтез на основе целлюлозы: Белок и другие ценные продукты. — Наука и техника, 1988.
5. Мороз И. В. и др. Поиск грибных продуцентов целлюлолитических ферментов. — 2013.