На основании данных анализа нуклеотидной последовательности гена 16SрРНК определена таксономическая принадлежность 19 культур фитопатогенных бактерий, изолированных из клубней топинамбура с признаками бактериозов. Выполнено молекулярное типирование выделенных бактериальных культур с помощью методов ERIC–ПЦР и BOX–ПЦР. Показано, что данные методы позволяют выявлять генетическую гетерогенность бактерий на уровне штамма.
Ключевые слова: молекулярно-генетическая идентификация, молекулярное типирование, ERIC–ПЦР, BOX–ПЦР, фитопатогенные бактерии.
Based on the analysis of the 16S rRNA gene sequence taxonomic affiliation of 19 isolated cultures of phytopathogenic bacteria causing diseases of the Jerusalem artichoke tubers were identified. Molecular typing of isolated bacterial cultures using ERIC–PCR and BOX-PCR was carried out. It was shown that these methods allow to detect genetic heterogeneity of bacteria on the strain level.
Keywords:molecular genetic identification, molecular typing, ERIC-PCR, BOX-PCR, phytopathogenic bacteria.
Оценка генетического разнообразия фитопатогенных бактерий имеет важное значение для эпидемиологии, селекции и контроля бактериозов сельскохозяйственных культур. Данные молекулярно-генетической идентификации могут быть применены для выяснения возможных источников инфекции, маркирования особо вирулентных штаммов, а также при изучении популяционной генетики и молекулярной филогении фитопатогенов.
Согласно сведениям литературы, геномы бактерий характеризуются наличием нескольких категорий повторяющихся последовательностей, таких как гены рРНК, тРНК, IS элементы, а также прямые повторяющиеся последовательности длиной 20–50 п.н. К последней категории относятся REP-последовательности (repetitive extragenic palindromic sequences) – повторы длиной 32 п.н., локализованные вне кодирующей области бактериального генома. Было показано, что праймеры, комплементарные консенсусной последовательности REP-повторов E. coli, могут быть успешно использованы для анализа различных бактериальных геномов. Метод REP-ПЦР с использованием праймеров ERIC зарекомендовал себя как нетрудоемкий и доступный подход к типированию микроорганизмов и выявлению их идентичности [1]. Метод BOX-ПЦР, предполагающий амплификацию повторяющихся BOX-элементов, также широко используется для видовой идентификации и штаммовой дифференциации микроорганизмов [2].
Цель исследования – молекулярно-генетическая идентификация фитопатогенных бактерий, изолированных из клубней топинамбура с признаками бактериального поражения.
Проведена молекулярно-генетическая идентификация 19 штаммов фитопатогенных бактерий, выделенных из клубней топинамбура с признаками бактериоза, на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК, поскольку данный метод рекомендован в качестве одного из стандартов. В результате амплификации на матрице геномной ДНК исследуемых культур с праймерами 8f и 1492r получены ПЦР-продукты размером ~1500 п.н., что соответствует полной нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. С помощью секвенирования определена нуклеотидная последовательность проксимального участка (~800 п.н.) амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК. С использованием программы BLAST и информационных ресурсов международной базы данных GenBank проведен филогенетический анализ секвенированных последовательностей. Установлено, что 10 штаммов относятся к виду Pseudomonassp., 5 штаммов – виду Stenotrophomonassp., 2 штамма – виду Serratia sp., 1 штамм – виду Xanthomonas sp., 1 штамм – Rahnella sp.
Полученные результаты свидетельствуют, что основными возбудителями бактериозов топинамбура являются бактерии рода Pseudomonas(52,6 % выделенных культур). Также часто встречаются бактерии родов Stenotrophomonas (26,3 %) и Serratia (10,5 %), а представители родов Xanthomonas и Rahnella составляют 5,3 % от выделенных культур.
Выполнено молекулярное типирование выделенных бактериальных культур с использованием методов ERIC–ПЦР и BOX–ПЦР в оптимизированных ранее условиях [3].
При проведении BOX–ПЦР были получены штаммоспецифичные фингерпринты, содержащие от 2 до 9 фрагментов размером 360–3000 п.н. В ERIC–фингерпринтах анализируемых штаммов также присутствовало 2–9 фрагментов размером 100–2200 п.н. Для штаммов 3н-1, 8-4, 9-1, 9-3, BOX-фингерпринты были нечеткими, ERIC–фингерпринты были нечеткими для штаммов 8-4, 9-1. BOX– и ERIC–фингерпринты штаммов 4-2, 4-3, 8-3, 9-4 и 5-4, 8-у были схожими. Для остальных штаммов фингерпринты характеризовались набором отличающихся ПЦР-продуктов и отражали генетическую гетерогенность культур. Полученные результаты подтверждают перспективное использование методов ERIC– и BOX–ПЦР для выявления генетического полиморфизма штамма фитопатогенных бактерий.
Работа выполнена в рамках ОНТП «Интродукция и озеленение».
Литература:
1. Epplen, J.T. Oligonucleotide fingerprinting using simple repeat motifs: a convenient, ubiquitously applicable method to detect hypervariability for multiple purposes / J.T. Epplen, H. Ammer, C. Epplen [et al.] // EXS. – 1991. – № 58. – P. 50–69.
2. Farber, J.M. An introduction to the hows and whys of molecular typing / J.M. Farber // J. Food Prot. – 1996. – № 59. – P. 1091–1101.
3. Фальковская, У.В. Генетическая характеристика фитопатогенных бактерий из фонда Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов / У.В. Фальковская, А.В. Сидоренко, Г.И. Новик // Биотехнология: реальность и перспективы: материалы Междунар. науч.-практ. конф., Саратов, 1–3 декабря, 2014 – С. 81–83.
