В работе представлены возможности повышения эффективности селекции сельскохозяйственных животных с помощью современных молекулярно-генетических методов.Дается краткий литературный обзор теоретических и практических аспектов использования метода полимеразной цепной реакции. Приведены данные о результатах использования метода ПЦР анализа в животноводстве, в том числе и собственные исследования. Обсуждаются направления увеличения эффективности метода, в частности, путем выявления геномных элементов, полиморфизм которых прямо ассоциирован с изменчивостью хозяйственно ценных признаков.
Ключевые слова: биотехнология, селекция, полимеразная цепная реакция, животноводство, полиморфизм генов, продуктивность.
Современные задачи ускоренной индустриализации животноводства, увеличения объемов производства животноводческой продукции по отношению к затратам требуют развития новых подходов к управлению генетическими ресурсами животных. В этой связи большие надежды возлагаются на современные достижения в области биотехнологий.
Современная биотехнология, основанная на методах молекулярной биологии, занимает ведущее положение в системе биологических, ветеринарных и зоотехнических исследований [4,6,11].
В результате открытия в 1953 году Д. Уотсоном и Ф. Криком структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) — носителя наследственной информации живых существ, описания комплементарности ее организации, стал понятен и объясним принцип генетики наследственности, что явилось основой новой области науки и технологий — ДНК-технологии. В общем, все методы ДНК-технологии, связанные с созданием новых генных конструкций и на их основе новых организмов, основаны на искусственном воспроизведении процессов, реально существующих в живой природе. Исследователи, по сути, не придумывая ничего нового, лишь используют приемы многократно реализованных в процессе эволюции живых организмов — изменчивость, наследственность и отбор [3].
Последние десятилетия ознаменовались изменением в подходах к совершенствованию домашних животных. Традиционно данные работы включали, как правило, многолетние наблюдения за продуктивными качествами отдельных особей с выявлением улучшителей и использование их в селекции. С развитием ДНК-технологий и накоплением фактического материала стало возможным через оценку генотипа в рамках концепции ген-маркерных признаков изучить все многообразие фенотипических форм и выявить желательные [1,2]. Наиболее перспективным методом выявления маркеров различных генов оказался метод полимеразной цепной реакции (Polymerasechainreaction PCR).
Настоящий переворот в молекулярной генетике произошел с момента открытия, удостоившегося Нобелевской премии, Кери Мюллисом с соавт. в 1986 году метода полимеразной — цепной реакции — ПЦР (polymerizechainreaction- PCR). В основе метода ПЦР лежит способность ДНК-полимераз, осуществлять направленный синтез второй, т. е. комплементарной цепи ДНК, по имеющейся матрице одноцепочной ДНК, наращивая небольшую олигонуклеотидную затравку (праймер), комплементарную участку этой матрицы, до размеров несколько тысяч или даже десятков тысяч звеньев. Собственно как метод ПЦР возникла тогда, когда стали использовать не просто ДНК — полимеразу, а так называемую термостабильную, которая была выделена из термофильной бактерий Thermusaquaticus (Taq), обитающих в горячих источниках, а позднее и биомассы действующих вулканов. Температурный оптимум работы фермента находится в области 70–720С [3].
Каждый цикл ПЦР состоит из трех этапов. На первом этапе необходимо денатурировать ДНК, для чего реакционную смесь нагревают до 92–950С, в результате двухцепочные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочных молекул. На втором этапе происходит отжиг (присоединение праймеров к ДНК- мишени с образованием коротких двухцепочных участков ДНК, необходимых для инициации синтеза). С образовавшимися комплексами праймер-матрица связывается ДНК- полимераза и на третьем этапе происходит одновременное копирование ДНК с двух праймеров, комплементарных участкам ДНК на противоположных цепях.
Двунитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. Важно, что синтезированные в ходе первого цикла ПЦР цепи ДНК также служат матрицами для второго цикла амплификации. Таким образом, происходит накопление ампликонов в реакционном растворе, теоретически в геометрической прогрессии.
Даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочная молекула ДНК, то за 30–40 циклов синтезируется столько молекул ампликона, что их концентрация достигается 10–20 мкг/мл. Этого количества достаточно для достоверного визуального обнаружения продукта ПЦР методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. [3].
Полимеразная цепная реакция в настоящее время является наиболее совершенным диагностическим методом молекулярной биологии и широко применяемым в ДНК-технологиях.
При оценке животных по генотипу применяется метод ПЦР-ПДРФ анализа, так как он имеет высокую чувствительность, точность, быстроту и простоту выполнения [1,2,3,4,7].
Открытие и выделение рестрицирующих эндонуклеаз, расщепляющих ДНК в участках со строго определенной последовательностью, позволило разработать маркеры на основе анализа рестрикционного полиморфизма ДНК (ПДРФ, англ. RFLP — Restriction Fragment Length Polymorphism) [3].
Впервые ПДРФ был использован как генетический маркер в 1974 г. при идентификации термочувствительной мутации в геноме аденовируса. Однако широкое применение вариантов полиморфизма ДНК в качестве генетических маркеров началось с 1980 г. после выхода работы Ботштейна, в которой изучены свойства ПДРФ как генетического маркера, дано теоретическое обоснование его использования и предложен метод оценки уровня информативности. ПДРФ используют для анализа полиморфизма конкретных локусов (генов). С использованием ПДРФ-маркеров были получены первые успешные результаты по построению молекулярно-генетических карт многих видов растений и животных, накоплены обширные сведения о генетическом полиморфизме различных организмов, выявлены ассоциации с хозяйственно-полезными признаками. Важным достоинством данного типа маркеров является высокая воспроизводимость результатов, а также кодоминантный тип наследования. ПДРФ-локусы могут обладать множественными аллелями, что повышает их информативность [3].
Одним из важных направлений ДНК-технологий является картирование геномов сельскохозяйственных животных. С 90-х годов 17 лабораториями из 9 стран реализуется программа картирования генома свиньи (ПигМеп), несколько позже запущена аналогичная программа по геному крупного рогатого скота, в ее участии принимает 30 лабораторий из 13 государств. В США финансируется национальный проект по картированию геномов КРС, свиньи, овцы, курицы. Новая Зеландия активно разрабатывает программу по картированию генома овцы [5].
К главным задачам картирования относятся:
- изучение положения локуса гена на конкретной хромосоме;
- определение генетического расстояния между генами, расположенными на одной хромосоме;
- выявление полиморфизм генов, т. е. всех аллельных вариантов;
- определение нуклеотидной последовательности генов, распределения в них интронов и экзонов, а также межгенетических последовательностей.
Развитие направления по картированию связано с усовершенствованием методов гибридизации insitu ДНК с меченными флуоресцентными красителями зондами.
В последнее время для картирования структурных генов или анонимных последовательностей небольшой длины до нескольких сот пар нуклеотидов стали применять метод ПЦР с использованием меченых нуклеотидов [3].
Основополагающей проблемой повышения эффективности селекционного процесса является изучение детерминант формирования высокой продуктивности и использования молекулярно-генетических маркеров в генетическом мониторинге и управлении селекционным процессом [1].
Разработка этой проблемы предусматривает решение задач по установлению связи локусов генома сельскохозяйственных животных с хозяйственно-ценными признаками и отбору значимых для селекционных целей маркеров высокой продуктивности MAS (MarkerAssistedSelection).
Многие фенотипические признаки, к которым относятся количественные признаки (QTL — quantitytradeloci) сельскохозяйственных животных, являются результатом интегрального взаимодействия многих генов. Поэтому при поиске хозяйственно-полезных признаков продуктивности, наиболее информативным является подход позиционного картирования, позволяющий одновременно оценивать состояние многих элементов генома, представленных на всех хромосомах [3,7].
Таким образом, современные ДНК-технологии в животноводстве, включают:
- создание новых форм организмов в целях получения животных-продуцентов терапевтически важных для человека белков;
- селекцию с помощью молекулярно-генетических маркеров MAS, предусматривающую картирование, маркирование главных количественных признаков — QTL;
- сохранение биоразнообразия с использованием молекулярно-генетических маркеров;
- разработку генетически обоснованных программ разведения и подбора родительских форм;
- молекулярно-генетический скрининг наследственных заболеваний сельскохозяйственных животных.
Главная цель селекционной работы заключается в подборе пар животных с высокой племенной ценностью для скрещиваний, позволяющих в следующем поколении добиться прогнозируемого селекционного успеха. Одним из основных направлений ДНК-технологий имеющих практическое значение в области животноводства является маркерная селекция. Массовое внедрение в животноводство ДНК-технологий позволяет изучить гены маркеры животных, которые контролируют и прогнозируют важные функции у животных. Генетическое маркирование на уровне ДНК позволяет тестировать животных любого пола и возраста [8].
Подобные исследования в области скотоводства позволили установить связь полиморфизма молочных белков с показателями молочной продуктивности, составом молока и его технологическими свойствами [9]. Современные ДНК-технологии позволяют идентифицировать генотипы молочных белков не только у лактирующих коров, как это было ранее, но и у производителей и молодняка. Таким образом, при генотипировании пород крупного рогатого скота молочного и двойного направлений продуктивности по аллельным вариантам ряда генов (каппа казеин, бета-лактоглобулин, соматотропный гормон, фактор регуляции транскрипции, лептин), ассоциированных с характеристиками молочной продуктивности (общий удой, процент жира, процент белка и т. д.) выявлена выраженная межпородная дифференциация по частотам встречаемости «молочных» аллелей: их частота статистически достоверно выше у молочных пород по сравнению с породами двойного направления продуктивности. Однако у индивидуальных молочных животных не обнаруживается сцепления между присутствием желательных «молочных» аллелей по разным локусам [5].
Подобные результаты были представлены в работах французских исследователей по использованию множественного генотипирования по SNP для выявления аллельных вариантов, ассоциированных с молочной продуктивностью у трех французских специализированных молочных пород [12, 14].
В свиноводстве на основании исследований, проведенных на трехпородных гибридах породы ландрас, йоркшир и дюрок, установлено влияние полиморфизма гена МС4R на откормочные и мясные качества. Для селекции по откормочным и мясным качествам «желательным» является генотип AG. Свиньи породы крупная белая генотипа AG отличаются лучшей скороспелостью на 5,35 дн. (3,16 %), среднесуточным приростом на 82,3г (9,9 %), меньшими затратами корма на 0,13 к. ед. (на 4,16 %) по сравнению с генотипом АА [7,8]. Установлено влияние генотипов по гену IGF2 на продуктивные качества свиней. Для селекции по откормочным качествам «желателен» генотип QQ. Свиньи крупная белая с генотипом QQ отличаются от аналогов qq-генотипа лучшей скороспелостью на 6,1 день (на 3,7 %), среднесуточным приростом на 59,7 г (7,7 %), толщиной шпика на 1,8 мм (7,8 %) и затратами корма на 0,1 к. ед. (3,2 %) [2,8].
Таким образом, анализ материалов о проведенных исследованиях и их результатах показывает потенциальную значимость ДНК-генотипирования в животноводстве с помощью метода ПЦР для интенсификации селекционного процесса. Эта технология позволит проводить генетическое моделирование будущего потомства с желательными генотипами и, соответственно, прогнозируемой продуктивностью, устойчивостью к заболеваниям. С помощью ДНК-технологий можно формировать специализированные линии для получения племенных животных с гомозиготным генотипом (для 100 % наследования желательного аллеля).
Литература:
1. Гетманцева Л. В. Полиморфизм гена MUC4 и воспроизводительные качества свиней /Л. В. Гетманцева, Н. В. Михайлов, А. Ю. Колосов, А. В. Радюк/ Известия нижневолжского агроуниверситетского комплекса: наука и высшее профессиональное образование. 2013. т. 1. № 3–1 (31). С. 143–146.
2. Гетманцева Л. В. Влияние полиморфизма генов MC4R, IGF2 и POU1F1 на продуктивные качества свиней. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук / Донской государственный аграрный университет.п. Персиановский, 2012.
3. Гетманцева Л. В. Влияние полиморфизма гена MUC4 на репродуктивные качества свиней / Л. В. Гетманцева, А. Е. Святогорова, М. А. Леонова, А.В.Усатов // Сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014" — Москва, март, 2014г. — С. 504–505.
4. Гетманцева Л. В. Использование ДНК-маркеров в селекции свиней / Л. В. Гетманцева, Е. А. Карпенко, Д. В. Чекотин// Перспективное свиноводство: теория и практика. 2012. № 1. С. 4.
5. Глазко В. И. ISSR-PCR маркеры и мобильные генетические элементы в геномах сельскохозяйственных видов млекопитающих / В. И. Глазко, Е. А. Гладырь А. В. Феофилов Н. В. Бардуков др.// Сельскохозяйственная биология — 2013. — № 2. — С. 71–76.
6. Глик Б.Молекулярная биотехнология. Принципы и применение /Б. Глик Дж. Пастернак// Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с.
7. Костюнина О. В. Полиморфизм гена рецептора меланокортина MC4R и его влияние на мясные и откормочные качества свиней /О. В. Костюнина, Н. А. Зиновьева, Е. И. Сизарева, А. И. Калугина, Е. А. Гладырь, Л. В. Гетманцева, М. С. Форнара, В. Р. Харзинова // Достижения науки и техники АПК. 2012. № 8. С. 49–51.
8. Леонова М. А.Перспективные гены-маркеры продуктивности сельскохозяйственных животных/ М. А. Леонова, А. Ю. Колосов, А. В. Радюк, Е. М. Бублик др.// Молодой ученый. 2013. № 12 (59). С. 612–614.
9. Леонова М. А.Разработка технологии обогащенного сывороточного кисломолочного напитка с функциональными свойствамиНаучно-технический вестник Поволжья. 2012. № 1. с. 191.
10. Максимов Г. В. Мясная продуктивность товарных гибридов свиней разных генотипов по гену POU1F1/Г. В. Максимов, Л. В. Гетманцева, А. Г. Максимов //Главный зоотехник. 2012. № 5. С. 13–15.
11. Третьякова О. Л.Инновационные технологии в животноводстве./О. Л. Третьякова, А. Ю. Колосов, Г.ИФедин //Вестник аграрной науки дона. 2013. № 2 (22). с. 87–94.
12. Flori L. The Genome Response to Artificial Selection: A Case Study in Dairy Cattle / L.Flori, S.Fritz, F.Jaffrezic, M. Boussaha et al. // PLoS ONE, 2009. Vol. 4.№.8.p.6595.
13. KalendarR., LeeD., SchulmanAH 2011. JavawebtoolsforPCR, in silico PCR, and oligonucleotide assembly and analysis. Genomics, 98(2): 137–144.
14. PedersenL. D. Genomic selection strategies in dairy cattle breeding programmes: Sexed semen cannot replace multiple ovulation and embryo transfer as superior reproductive technology/ L. D. Pedersen, M.Kargo, P. Berg, J.Voergaard, et.al. //J. Anim. Breed. Genet. — 2012. — Vol.129 — P. 152–163.
