Основные методы определения ГМО в продукции

В данной статье описываются значение определения ГМО в продукции, причины разработок методов определения и мониторинга ГМО в продукции. Также рассмотрены характеристики основных методов, которыми пользуются при определении ГМО в продуктах питания.

Ключевые слова: ГМО, трансген, апликон, праймер, олигонуклеотиды, секвенирование, иммуноанализ.

Введение трансгена часто ассоциируется с предполагаемыми и непреднамеренными изменениями на геномных, протеомных и метаболических уровнях, которые потенциально влияют на качество и безопасность продуктов питания и кормов [1]. Поэтому данные молекулярной характеристики в отношении полных последовательностей вставки и их локализации особенно важны как для разработчиков, так и для оценщиков риска и регуляторов ГМ-культур. На секретариате Конвенции о биологическом разнообразии было согласованно что генетически модифицированные (ГМ) культуры могут быть коммерциализированы после тщательной оценки безопасности и только в том случае, если они считаются безопасными [2]. Важное значение для оценки безопасности и маркировки ГМО имеет молекулярная характеристика трансгенных вставок на уровне хромосом, включая последовательность вставок его фланкирующей последовательности [3]. Эти данные также служат основой для разработки и проверки конкретных методов обнаружения для мониторинга ГМО продукции [4]. При постоянном расширении исследований и разработок ГМО все чаще поступают сообщения о пищевых продуктах и кормах, незаконно содержащих неизвестные выпущенные ГМО. В качестве примера можно привести, но не ограничиваются ими, кукурузу StarLink (CBH351, UI = ACS-ZMØØ4–3), рис GM LL601 (UI = BCS-OSØØ3–7), Kemingdao и Kefeng 6 и лён FP967 (UI = CDC -FLØØ1–2), что вызвало общественные возмущения и нарушения международной торговли. Кроме того, перед властями стоит очень сложная задача обнаружить неизвестные ГМО продукты, для которых нет никакой информации [5].

Метод полимеразной цепной реакции

Один из широко применяемых методов определения ГМО основан на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Все ПЦР анализы требуют, чтобы последовательность целевой ДНК была известна [6]. Также важным моментом является выделение и очистка ДНК в образце. Технология ПЦР стала единственным надежным методом, позволяющим определить присутствие определенной последовательности ДНК из образцов, содержащих малое количество или плохое качество ДНК. Например, можно протестировать наличие определенной последовательности ДНК в довольно старом или сильно обработанном образце [7]. Методы определения ГМО на основе ПЦР были классифицированы в соответствии с их уровнем специфичности: (I) широко используемые последовательности, такие как P-35S (CaMV 35S промотор), T-35S (CaMV 35S терминатор), T-Nos(терминатор гена нопалин-синтазы), bla (β-lactamase), иnptII (неомицинфосфотрансферазаII); (II) последовательности в пределах интересующего гена (собственно трансгена); (III)конструктивно-специфические последовательности, примером является соединение между промоторной последовательности и самого трансгена; (IV)случайно-специфические последовательности, такие как сайт интеграции трансгена [8]. За последние десятилетия было разработано несколько праймеров, но некоторые из них имеют довольно ограниченный диапозон применения. Все большее число случайно-специфических последовательностей встречаются в ГМ-культурах, например, RoundupReady (RR) в сое [9–11], MON810 [12,13], Bt11 [14], Starlink [15], NK603 [16], MON863 [17] в кукурузе и Mon1445, Mon531 [18] на хлопчатнике. Некоторые методы, подходящие для обнаружения «неизвестно случайных» последовательностей, представлены олигонуклеотидными анализами, а не ПЦР.

Существуют несколько методов аутентификации ампликонов [19,20]:

‒ Проверка размера ампликона методом гель-электрофореза. Это может дать ложный положительный результат, когда нецелевая последовательность с той же длиной, что и целевая, были амплифицированы. Проверка может быть улучшена если в целевой последовательности присутствует сайт рестрикции, путем соответствующего рестрикционного переваривания.

‒ Проверка ампликона с помощью гибридизационного анализа. Это надёжный метод, но он требует много времени и затрат

‒ Использование вложенной ПЦР (с англ. nested PCR) для различения целевых и нецелевых ампликонов.

‒ Секвенированиеампликона. Это самый надежный способ аутентификации, и в тех случаях, когда доступны недорогие услуги секвенирования, это предпочтительный метод

Мультиплексные методы ПЦР

В мультиплексной ПЦР включены несколько пар праймеров, чтобы обеспечить одновременное обнаружение нескольких целевых последовательностей. Такие системы были разработаны для ряда конструктивно-специфических последовательностей [21,22]. Восемь сортов ГМ-кукурузы внонаплексном (девять пар праймеров) ПЦР анализе, в котором каждый образец содержал по 0,25 % других (образцов 7 сортов ГМ-кукурузы), были успешно установлены и отделены друг от друга в образцах [23]. Как правило, различные продукты ПЦР отличаются друг от друга на основе их дифференциальной миграции через агарозныегели.который заключается в том, что она может быть легко адаптирована к высокопроизводительному режиму.Особое преимущество такого анализа заключается в том, что ее можно легко адаптировать к высокопроизводительному режиму.

Количественные методы ПЦР

Количественная ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) представляет собой наиболее мощное средство тока для количественного определения ГМ-культур [7]. Он работает, непрерывно контролируя реакцию амплификации, используя силу сигнала флуоресценции, чтобы указать количество присутствующего ампликона [24].СпецифичностьQRT-PCR зависит как от химии, используемой для контроля амплификации, так и от контрольно-измерительной аппаратуры, используемой для контроля сигнала.Для оценки количества ГМ в образце, обычно выполняются две параллельные реакции, каждая из которых содержит такое же количество ДНК: одна нацелена на эндогенную эталонную последовательность, а другая — конкретная ГМ-последовательность. Количественное определение достигается либо путем сравнения, основанного на пороговом значении цикла двух амплифицированных последовательностей (метод ΔCt), либо путем титрования по стандартной кривой. Выбор эталонных материалов для построения калибровочных кривых является важной проблемой в количественной оценке ГМ. Они могут быть получены из известных чистых ГМ культур или не ГМ-материалов, смешанных в известных пропорциях. Такой сертифицированный справочный материал (CRM) ограничен только несколькими видами растений, в частности кукурузой, соей, рапсом, хлопком, картофелем и сахарной свеклой. Имеются справочные материалы, содержащие 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 5 % ГМ-концентрации для кукурузы Bt-176, Bt11, MON 810, NK603; для соевого RR; 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 1,7 %, 4,3 % для кукурузы GA21; 0 %, 0,1 %, 1 %, 10 % для кукурузы MIR604; DAS-59122; TC1507. 1 % эталонный материал доступен для хлопка 281–24–236 × 3006–210–23, рапса GT73, GS40 / 90, MS8xRf3 и Oxy235 и картофеля EH92–527–1, а также 0 % и 100 % эталонного материала для сахарной свеклы H7–1.

Иммуноферментный метод

Иммуноанализы представляют собой аналитические измерительные системы, которые используют антитела в качестве тестовых реагентов. Антитела представляют собой белки, продуцируемые в сыворотке животных в ответ на чужеродные вещества (антигены) и специфически связывают вещество, которое вызывает их продукцию. В случае обнаружения ГМО антиген может быть вновь синтезированным белком. Предпосылкой для разработки методов иммунологического обнаружения является наличие высокоспецифических антител, направленных против белка, подлежащего обнаружению. Кроме того, образец или представляющий интерес белок не должны быть значительно деградированы или денатурированы.

Иммунологические методы стали незаменимыми инструментами в физиологических, биохимических и молекулярных дисциплин науки о растениях. Их главная привлекательность заключается в высокой специфичности иммунологической реакции, которая позволяет точно распознавать антигенное вещество даже в присутствии мешающих соединений. Методология теперь обычно используется для быстрой очистки, визуализации и количественной оценки белков, полисахаридов и даже малых молекул (гаптенов), и в этом случае специфическое продуцирование антител индуцируется конъюгацией с иммуногенным белком-носителем.

Наиболее распространенным типом иммуноанализа является иммуноферментный анализ с ферментным связыванием (ELISA), в котором используется меченый ферментом иммунореактивный агент (антиген или антитело) и иммуносорбент (антиген или антитело, связанное с твердой подложкой) для измерения неизвестной концентрации антигена.

До настоящего времени было разработано несколько методов на основе ELISA, которые специфичны для генных продуктов, широко экспрессируемых в трансгенных растениях, таких как продукт гена неомицинфосфотрансферазыII (nptII), Bacillusthuringiensis (Bt), инсектицид Cry1Ab, и белок фосфинотрицин-ацетилтрансферазы (PAT), устойчивый к гербицидам. Белок nptII был экспрессирован и очищен от генетически модифицированных хлопковых хлопьев, клубней картофеля и томатов [25]. Модифицированный метод ELISA, также основанный на обнаружении nptII, успешно применяется к ряду независимо трансформированных линий у девяти видов растений.

Одним из основных недостатков иммунохимических анализов является то, что на их точность могут неблагоприятно влиять сложные матрицы, такие как обработанные растительные и пищевые продукты. Действительно, многие вещества, присутствующие в пищевых матрицах, таких как поверхностно-активные вещества (сапонины), фенольные соединения, жирные кислоты, эндогенные фосфатазы или ферменты, могут ингибировать специфическое взаимодействие антиген-антитело. Более того, способность обнаружения может быть затруднена, когда трансгенный белок экспрессируется на очень низком уровне или деградирует и денатурируется термической обработкой. Недавно выделенный белок не может быть равномерно присутствующим во всей тканях растения. Например, в кукурузе наивысшие значения экспрессии для некоторых белков наблюдается главным образом в листьях, а не в зерне. Наконец, коммерчески доступные антитела могут проявлять низкое связывающее родство к интересующему белку.

Одной из проблем, с которой столкнулись аналитики ГМО являются быстрые темпы развития ГМ-установок, в которых присутствуют новые и множественные гены / элементы генетического контроля. Например, Хеммер (1997) уже сообщил, что некоторые одобренные ГМ-культуры не содержат ни промотора 35S, ни терминатора nos. Хотя создание «регистров генов» и использование передовых биоинформационных систем может помочь в получении предварительного знания о возможных типах генетических модификаций, требуются новые технологии и инструменты для высокой пропускной способности и низкой стоимости обнаружения все большего разнообразия генов. Новые технологии, возникающие в результате слияния микросистем, основанных на микросхемах, таких как микрочипы и микрожидкостные системы, по-видимому, являются многообещающей областью для анализа ГМО.

Микроматрицы были использованы для анализа экспрессии, обнаружения полиморфизма, секвенирования ДНК и генотипирования. Микрофлюидные системы имеют приложения, от реакций до разделения и анализа, и могут в конечном итоге привести к разработке микроаналитических систем (mTAS), которые выполняют полный анализ, включая выборку и предварительную обработку образца.

Микрофлюидальные системы имеют приложения, от реакций разделения до анализа, и могут в конечном итоге привести к разработке микроаналитическихсистем (mTAS), которые выполняют полный анализ, включая отбор проб и предварительную обработку образца.

Технология микрочипов направлена на автоматизацию сложных рабочих процедур аналитической лаборатории путем переноса их на небольшой кусок стекла или пластика, так называемый чип.

Например, в системе на основе микрочипов микроскопические массивы молекул ДНК иммобилизуются на твердой подложке. Основываясь на принципе гибридизации ДНК с последующим мониторингом, как правило, с измерениями флуоресценции, возможен одновременный анализ нескольких тысяч нуклеиновых кислот на очень небольшой площади кристалла. Таким образом, система микрочипов экономит время и затраты, сохраняя высокую точность и воспроизводимость. В микрожидкостной системе можно моделировать насосы, клапаны, реакционные трубки и даже аналитические приборы путем умной транспортировки жидкостей через миниатюрные каналы (5–20 мм), расположенные на одном чипе. Среди преимуществ — повышенная производительность (например, более быстрое охлаждение и время нагрева, более быстрая диффузия по каналам, улучшенная скорость разделения), бесступенчатый транспорт (электроосмотический или электрохимический поток), снижение потребления реагентов, переносимость, возможность параллелизация процедур и высокая пропускная способность образцов.

Одной из микротехнологий, которая может быть использована для анализа ДНК и белка, является поверхностный плазмонный резонанс (SPR). В частности, SPR проявил себя как хорошо подобранный метод для изучения кинетики биомолекулярных взаимодействий между макромолекулами в реальном времени без метки, т. е. взаимодействия антиген-антитело, взаимодействия белок-ДНК и взаимодействия рецептор-лиганд.

SPR проистекает из одного из основных принципов оптики, который имеет общую внутреннюю отражательную способность, и возникает, когда тонкая проводящая пленка размещается на границе раздела материалов с различными показателями преломления. Если лиганд можно конъюгировать с поверхностью биосенсорного чипа, то прикрепление свободного целевого аналита, присутствующего в растворе, можно измерить как функцию увеличения массы. Изменение угла отраженного света (пропорциональное разности масс на поверхности кристалла) до и после инкубации регистрируется в «сенсорной диаграмме» и измеряется в относительных единицах (R.U.). Соответственно, изменения уровней ответа в шипиковых образцах могут быть сопоставлены с известными концентрациями аналита.

Minunnietal. в 2000-м году предложили использовать биосенсорные технологии, включая SPR для скрининга в анализе ГМО. Они выделили несколько преимуществ этой технологии, включая экономию времени, простоту использования и низкие затраты. Эти исследователи получили предварительные хорошие результаты с помощью электрохимического биосенсора с олигонуклеотидными зондами 35S и NOS-терминатором олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных в качестве улавливающего агента на экранном электроде. Зонды распознавали комплементарные последовательности ДНК, когда они подвергались воздействию целевого аналита в растворе, причем система была гораздо более чувствительной к 35S, чем мишень nos. Ссылочными аналитами были синтетические олигонуклеотиды и ПЦР-амплифицированные образцы ДНК из сертифицированного справочного материала сои сои (Fluka).

Литература:

1. Sparrow, P. GM risk assessment. Molbiotechnol 44, 267–275 (2010).
2. Secretariat of the Convention on Biological Diversity. Secretariat of the Convention of Biological Diversity (2000).
3. Codex Alimentarius. Guideline for the conduct of food safety assessment of foods derived from recombinant-DNA plants. CAC/GL 45, 1–18 (2003).
4. Miraglia, M. et al. Detection and traceability of genetically modified organisms in the food production chain. Food ChemToxicol 42, 1157–1180 (2004).
5. Ruttink, T. et al. Molecular toolbox for the identification of unknown genetically modified organisms. Anal BioanalChem 396, 2073–2089 (2010).
6. Peano C, Samson MC, Palmieri L, Gulli M, Marmiroli N (2004) J Agric Food Chem 52:6962–6968
7. Marmiroli N, Maestri E (2007) In: Picò Y (ed) Food toxicants analysis techniques, strategies and development. Elsevier, Amsterdam, pp 147–187 ISBN 978–0–444–52483–8
8. Holst-Jensen A, Rønning SB, Lovseth A, Berdal KG (2003) Anal BioanalChem375:985–993
9. Berdal KG, Holst-Jensen A (2001) Eur Food Res Technol 213:432–438
10. Taverniers I, Windels P, Van Bockstaele E, De Loose M (2001) Eur Food Res Technol 213:417–424
11. Terry CF, Harris N (2001) Eur Food Res Technol 213:425–431
12. Hernández M, Pla M, Esteve T, Prat S, Puigdomenech P, Ferrando A (2003) Transgenic Res 12:179–189
13. Holck A, Vaitilingom M, Didierjean L, Rudi K (2002) Eur Food Res Technol 214:449–454
14. Rønning SB, Vaitilingom M, Berdal KG, Holst-Jensen A (2003) Eur Food Res
15. Technol 216:347–354
16. Windels P, Bertrand S, Depicker A, Moens W, Van Bockstaele E, De Loose M (2003) Eur Food Res Technol 216:259–263
17. Huang HY, Pan TM (2004) J Agric Food Chem 52:3264–3268
18. Pan A, Yang L, Xu S, Yin C, Zhang K, Wang Z, Zhang D (2006) J Cereal Sci 43:250–257
19. Yang L, Pan A, Zhang K, Yin C, Qian B, Chen J, Huang C, Zhang D (2007) Transgenic Res 14:817–831
20. TengsT, Kristoffersen AB, Berdal KG, ThorstensenT, Butenko MA, Nesvold H, Holst-Jensen A (2007) BMC Biotechnol 7:91 Dec18
21. Anklam E, GadaniF, HeinzeP, Pijnenburg H, Van Den Eede G (2002) Eur Food Res Technol214:3–26
22. Peano C, Bordoni R, Gulli M, Mezzelani A, Samson MC, De BellisG,MarmiroliN(2005)AnalBiochem346:90–100
23. Germini A, Zanetti A, Salati C, Rossi S, Forre C, Schmid S, Fogher C, Marchelli R (2004) J Agric Food Chem 52:3275– 3280
24. Onishi M, Matsuoka T, Kodama T, Kashiwaba K, Futo S, Akiyama H, Maitani T, Furui S, Oguchi T, Hino A (2005) J Agric Food Chem 53:9713–9721
25. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM (1996) Genome Res6:986–994
26. Fuchs et al., 1993, Rogan et al., 1992, Wood et al., 1995.