Современные подходы к изучению популяции муксуна Обь-Иртышского рыбохозяйственного района

Современные подходы к изучению популяции муксуна Обь-Иртышского рыбохозяйственного района

Кабицкая Яна Александровна, аспирант;

Коновалова Татьяна Алексеевна, аспирант;

Бойко Елена Григорьевна, кандидат биологических наук, доцент

Государственный аграрный университет Северного Зауралья (г. Тюмень)

Настоящая статья посвящена исследованию внутривидовой изменчивости муксуна, обитающего в реке Обь (точка наблюдения Ямбура) во временном аспекте (2012 – 2014 гг.). На основании полученных данных проведен анализ внутривидовой изменчивости гена цитохром B (Сyt B) митохондриальной ДНК 89 экземпляров муксуна. Исследованные особи имеют одинаковый митохондриальный гаплотип и обладают низкой степенью полиморфизма по анализируемому локусу.

Ключевые слова: муксун Сoregonus muksun, генетическая структура популяций, ДНК-анализ, мтДНК, цитохром B, полиморфизм, секвенирование.

Введение. Муксун (Сoregonus muksun), обитающий в пределах Обь-Иртышского рыбохозяйственного района, представляет собой единую популяцию (стадо) и является ценным промысловым видом рыб. По систематическому положению муксун относится к типу Хордовые (Chordata), отряду Лососеобразные (Salmoniformes), семейству Сиговые (Coregonidae), роду Сиги (Coregonus) (Pallas, 1814). В таксономическом отношении он представляет собой наиболее сложную для изучения группу [1]. Долгое время в Обь-Иртышском рыбохозяйственном районе муксун [2] являлся приоритетным объектом промысла, вследствие чего его запасы резко снизились [3]. В Обском бассейне этот вид относится к ценным промысловым видам рыб, с резко сокращающейся численностью из-за нерационального промысла, нефтяного загрязнения и других факторов (рис. 1). В настоящий момент управление рыбными запасами осуществляется без учета внутривидовой структуры. Это может повлечь нарушение целостности вида в целом и негативно отразиться на его численности [4]. По инициативе ФГБНУ «Госрыбцентр» вылов муксуна в Обь-Иртышском рыбохозяйственном районе запрещен с 15.08.2014 г.

Рис. 1. Динамика вылова муксуна в водных объектах Тюменской области [4]

Научная новизна данных исследований заключается в последующем использовании генетических маркеров для идентификации популяций и отдельных особей муксуна. Особая значимость этого исследования связана с искусственным воспроизводством муксуна и формированием генетических паспортов маточных стад.

Целью настоящей работы являлось изучение генетических особенностей муксуна из реки Обь (точка наблюдения (т.н.) Ямбура) в разные периоды времени (2012-2014 гг.).

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Произвести сбор и пополнить коллекцию биологических тканей (плавник) муксуна Обь – Иртышского рыбохозяйственного района.
2. Выделить ДНК и провести генетический анализ гена Cyt B митохондриальной ДНК (мтДНК) муксуна из реки Обь (т.н. Ямбура) в разные периоды времени (2012-2014 гг.).

Материалы и методы. Материалом для исследования послужил муксун из реки Обь в районе точки наблюдения Ямбура в количестве 89 экземпляров (рис. 2).

Рис. 2. Карта района сбора материала: 1 - река Обь (т.н. Ямбура)

Сбор тканей плавников муксуна осуществлен с 2012 по 2014 гг. сотрудниками эколого-сырьевых исследований ФГБНУ «Госрыбцентр». Пополнена коллекция тканей муксуна: 17 экземплярами в 2012 г., 9 - в 2013 г., 63 - в 2014 г.

Генетические исследования выполнены в молекулярно-генетической лаборатории Агробиотехнологического центра ГАУ Северного Зауралья и в лаборатории молекулярной генетики гидробионтов ВНИРО (г. Москва).

Выделение тотальной ДНК проводилось фенольным [5] и солевым методами с лизированием протеиназой К с использованием плашек PALL. Анализ количественной оценки тотальной ДНК проводился с помощью спектрофотометра.

Полноразмерная последовательность гена Сyt B (около 1100 п.н.) митохондриальной ДНК была амплифицирована на амплификаторе "Bio-Rad" T 100 Thermal Cycler с использованием праймеров: GluDG и H16460. Реакция ПЦР - анализа проводилась в конечном объеме 25 мкл с 1 х ПЦР буфером (16,6 мМ (NH₄)2SO₄, 67,7 мМ Трис-HCl, рН=8,8, 0,1% (v/v) Tween 20), 1мкл 50 мМ MgCl₂, 5 мкл смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, 150 пмоль праймера и 1 единиц Tag-полимеразы. В 0,5 мл пробирки вносились по 24 мкл реакционной смеси и 1 мкл исследуемой тотальной ДНК. Амплификация проводилась по схеме, представленной в таблице 1.

Программа амплификации

Длина ПЦР продукта варьировала до 1100 пар оснований. Визуализация ПЦР продукта проводилась в 2% агарозном геле в 0,5x кратном ТБЕ буфере и разгонялась в течение 30 минут при напряжении 120 V, окрашивание проводилось бромистым этидиумом. Детекция результатов проводилась на гель - сканере "Typhoon 8600" ("Molecular Dynamics").

Секвенирование проводилось с праймера GluDG на автоматическом секвенаторе АВI 3100 Genetic Analezer (Applied Biosystems, США) с использованием набора для секвенирования BigDye v. 1.1. Кроме полученных данных, использована одна депонированная из базы данных GenBank, NCBI последовательность. Выравнивание и сборка контигов проводились путем анализа хроматограмм в программе "SeqMan", множественное выравнивание и последующее построение дендрограмм в программе "MegAlign" (Lasergene, США).

Результаты и их обсуждение. В последние годы генетические исследования стали применять более активно. Совершенствование технологии в области секвенирования открыли новые возможности в области популяционной генетики сиговых рыб, в частности, муксуна. Анализ видового состава с использованием мтДНК имеет ряд преимуществ по сравнению с анализом ядерных генетических маркеров: наличие большой копийности, устойчивости кольцевой структуры мтДНК к деградации и лучшая сохранность.

Исследования по локальным группировкам муксуна в данном направлении представлены единичным работами. По данным Балдиной С.Н. и др. [6] гаплотипы муксуна из разных бассейнов Сибири образуют общую группу с гаплотипами ледовитоморского пыжьяна.

Исследованы последовательности гена Cyt B 89 особей муксуна из реки Обь (т.н. Ямбура) в периоды сбора биоматериала с 2012 по 2014 гг. Проанализированы 89 последовательностей нуклеотидов гена Сyt B длиной 800 п.н.. На основании секвенирования гена Cyt B мтДНК построена дендрограмма генетического сходства изученных особей муксуна (рис. 3).

Рис. 3. Дендрограмма (NJ) генетического сходства последовательностей гена Cyt B у изученных особей муксуна

Дендрограмма демонстрирует генетическое расстояние между исследованными особями муксуна. Очевидно, что все особи группируются в единый кластер. Отдельную ветвь образует лишь одна особь. Учитывая незначительную генетическую разобщенность особей муксуна, а также одинаковые экологические условия обитания, можно предположить, о единстве популяции муксуна. Анализ полиморфизма SNP локусов выявил сходство и незначительные различия проанализированных особей муксуна из реки Обь. Полиморфные участки, предполагающие генетические различия, были отобраны, секвенированы и проанализированы программой "BLAST" на аналогию с последовательностями, имеющимися в GeneBank. Очевидно, что исследованные 75 гаплотипов характерны для C.muksun.

У 14 гаплотипов выявлен незначительный полиморфизм, представленный точечными мутациями (SNP) (табл. 2). Следует отметить, что однонуклеотидный полиморфизм (SNP) широко используют в качестве молекулярно-генетических меток (маркеров) для построения молекулярно-генетической систематики на основе дивергенции (расхождения) гомологичных участков ДНК в филогенезе.

Анализ генетической гетерогенности популяции муксуна

Полученные результаты генетических особенностей исследованных особей муксуна, выловленных из реки Обь (т.н. Ямбура) с 2012 по 2014 гг. не дает нам достаточных оснований для выделения муксуна данного района в отдельные комплексы. Можно предположить, что низкий уровень генетической изменчивости указывает на принадлежность исследованных особей муксуна к одной популяции. Очевидно, что для окончательного разъяснения данных задач потребуется провести дополнительное исследование по другим генетическим маркерам. Представленные результаты требуют дальнейших исследований: увеличение набора дифференцирующих признаков, привлечения большего числа особей и увеличение точек сбора материала.

Выводы. На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:

1) Впервые исследована нуклеотидная последовательность гена цитохром B митохондриальной ДНК у 89 особей муксуна из реки Обь (точка наблюдения Ямбура), выловленных с 2012 по 2014 гг.

2) Выявлен низкий уровень нуклеотидного разнообразия гена цитохром B митохондриальной ДНК в исследованных выборках муксуна из реки Обь (т.н. Ямбура). Все исследованные особи муксуна объединены в один мономорфный кластер, что свидетельствует о значительной генетической однородности вида в пределах изученного ареала.

Литература:

1. Решетников Ю.С. Экология и систематика сиговых рыб. – М.: Наука, 1980. 301 с.
2. Кабицкая Я.А. Муксун (Coregonus muksun) Обь - Иртышского бассейна// Молодой ученый, 2015, №6.5, С. 170-172.
3. Гриценко О.Ф., Котляр А.Н., Котенёва Б.Н. Промысловые рыбы России. – Т. 1. – М.: ВНИРО, 2006. 1190 с.
4. Матковский А.К. Деградационные процессы в популяции муксуна реки Оби и необходимые меры по восстановлению его численности // Биология, биотехника разведения и состояние запасов сиговых рыб. Седьмое международное научно-производственное совещание «Проблемы современного товарного сиговодства Зауралья». – Тюмень, 2010. С. 176 –181.
5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д., Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование М.: Мир, 1984. 480 с.
6. Балдина С.Н., Гордон Н.Ю., Политов Д.В. Генетическая дифференциация муксуна Coregonus muksun (Pallas) и родственных видов сиговых рыб (Coregonidae, Salmoniformes) Сибири по мтДНК// Генетика, 2008, Т. 44, № 7, С. 896-905.