Поиск новых видов светящихся бактерий



Цель работы

Основная цель работы — поиск и исследование новых видов светящихся бактерий.

Известно, что в Белом море обитают рыбы, у которых в кишечнике содержатся люминесцентные бактерии. В данной работе проведён поиск новых видов светящихся бактерий. Микроорганизмы, посеянные на среды Куц-Исмаилова и SWT, снимали в тёмной камере на наличие светимости. Образцы, которые светились, были отправлены на секвенирование генома.

В Белом море встречаются такие виды люминесцентных бактерий, как Aliivibrio logei, Photobacterium phosphoreum и другие, ещё не известные нам виды. Они содержат особый фермент люциферазу, благодаря которому светятся. Такое свечение привлекает рыб. Увидев светящийся объект, рыба пытается съесть его. Так бактерии попадают в кишечник рыбы. Рыбья кишка является благоприятной средой для роста и развития бактерий. Бактерии вновь попадают в окружающую среду вместе с каловыми массами.

Для людей люцифераза также имеет важное значение. Её гены находят широкое применение в качестве генов-репортёров для построения цельноклеточных биосенсоров, которые детектируют наличие токсикантов в окружающей среде и являются удобным индикатором для оценивания эффективности транскрипции в научных задачах. Кроме того, изучение светящихся организмов имеет и бытовое применение, например, создание экономичных и экологически чистых средств освещения для дома и улицы. Так как бактерии светятся, их можно обнаружить с помощью фотосъёмки в тёмной камере чувствительным фотоаппаратом. Для того, чтобы определить вид таких бактерий, понадобится секвенирование.

Материалы и методы

Рыба: Рыба была выловлена в июле в Белом море. Использовано содержимое кишечника следующих видов рыб: Навага ( Eleginus nawaga ), Треска ( Gauds morhua marisalbi ), Бычок ( Myoxocephalus scorpius ), Камбала ( Platichthys flesus ) Беломорская сельдь ( Clupea pallasii marisalbi ) Азиатская корюшка ( Osmerus mordax dentex)

Обыкновенная или полосатая зубатка (Anarhichas lupus)

Питательные среды и условия культивирования: Сеяли бактерий на агаризованую среду в боксе методом исчезающего штриха; рост бактерий осуществлялся при температуре 15°С в течение нескольких суток. Использованные питательные среды: SWT-агар (%, в./об.): 0,25 % дрожжевого экстракта, 0,5 % триптона, 1,5 % морской соли, 1.5 % агар и 0,3 %, об./об. глицерина

Результаты

В начале данной работы проводилось вскрытие рыбьего кишечника, выделение оттуда кишечных масс и посев их на чашки Петри. Затем с помощью чувствительного фотоаппарата чашки были отсканированы в тёмной камере на источники света. Результаты такого анализа приведены в таблице 1.

Таблица 1

Светимость образцов

Номер	Дата	Среда	Рыба	Светимость
1	12.07	SWT	Бычок-1	+
2	12.07	SWT	Корюшка-1	-
3	12.07	SWT	Зубатка	+
4	12.07	SWT	Навага-1	-
5	12.07	SWT	Навага-2	+
6	12.07	SWT	Навага-3	+
7	12.07	SWT	Треска-1	+
8	12.07	SWT	Треска-2	+
9	12.07	SWT	Треска-3	+
10	12.07	SWT	Треска-4	+
11	12.07	SWT	Треска-5	-
12	13.07	SWT	Бычок-2	-
13	13.07	SWT	Бычок-3	+
14	13.07	SWT	Корюшка-2	+
15	13.07	SWT	Камбала	-
16	13.07	SWT	Навага-4	+
17	13.07	SWT	Навага-5	+
18	13.07	SWT	Навага-6	+
19	13.07	SWT	Треска-6	+
20	13.07	SWT	Треска-7	+
21	13.07	SWT	Треска-8	+
22	13.07	SWT	Треска-9	+
23	14.07	SWT	Треска-10	+
24	14.07	SWT	Треска-11	+
25	14.07	SWT	Треска-12	+
26	14.07	SWT	Треска-13	+
27	14.07	SWT	Треска-14	-
28	14.07	SWT	Треска-15	+
29	14.07	SWT	Треска-16	+
30	14.07	SWT	Треска-17	-
31	14.07	SWT	Треска-18	-
32	14.07	SWT	Треска-19	+
33	14.07	SWT	Треска-20	+
34	15.07	SWT	Сельдь-1	+
35	15.07	SWT	Сельдь-2	+
36	15.07	SWT	Треска-21	+
Номер	Дата	Среда	Рыба	Светимость
37	15.07	SWT	Треска-22	+
38	15.07	SWT	Треска-23	+
39	15.07	SWT	Треска-24	+
40	15.07	SWT	Треска-25	-
41	15.07	SWT	Треска-26	+
42	15.07	SWT	Треска-27	+
43	15.07	SWT	Навага-7	-

Ниже можно увидеть фотографии чашек Петри с образцами (Рис. 1–7):

Рис. 1. Образец 1

Рис. 2. Образец 2 (не светится)

Рис. 3. Образец 7

Рис. 4. Образец 9

Рис. 5. Образец 10

Рис. 6. Образец 19

Рис. 7. Образец 24

Как можно видеть, в кишечных массах встречаются бактерии, испускающие свет. Причём светятся они не одинаково. Из этого можно сделать вывод, что среди образцов встречается несколько видов бактерий.

В дальнейшем образцы были перевезены в Москву, в биолабораторию МФТИ. Многие образцы перестали светиться через неделю. Наиболее светящиеся были пересеяны, из них была выделена ДНК для секвенирования.

Проверка на светимость на люминометре:

1. 200 мкл жидкой среды SWT
2. Единично изолированная колония образца
3. Первый замер без деканаля
4. 2 мкл 0.1 % деканаля
5. Второй замер с деканаль

Выделение геномной ДНК из бактерий:

1. 400 мкл 4.5 CH ₃ COONa 7.5M
2. Носиком пипетатора снять с агаризованной среды колонию и ресуспендировать
3. Держим 10 мин при комнатной температуре
4. 2 мин центрифугируем на скорости 14,000 об/мин, слить надосадочную жидкость (супернатант)
5. 30 сек центрифугируем на скорости 14,000 об/мин, слить супернатант
6. Добавляем 200 мкл буфер, ресуспендируем
7. 8 мин держим в термостате при t = 65℃
8. +100 мкл CH ₃ COONa 7.5M, встряхнуть
9. +100 мкл хлороформ
10. 2 мин центрифугируем на скорости 14,000 об/мин
11. Переместить верхнюю фазу в новый эппендорф, добавить изопропанол 1:1
12. 6 мин центрифугируем на скорости 14,000 об/мин
13. Добавить 200 мкл 70 % этанола, 5 мин центрифугируем на скорости 14,000 об/мин, слить супернатант
14. +20–40 мкл H ₂ O mQ, хранить при 4–5℃

Приготовление ПЦР смеси (25 мкл):

– 5X Q5 буфер — 5 мкл

– 10 mM dNTP — 0.5 мкл

– 10 μM Forward Primer — 1.25

– 10 μM Reverse Primer — 1.25

– ДНК — < 1 мкг

– ДНК-полимераза Q5–0.25 мкл

– H ₂ O mQ — 25 мкл

Приготовление 50X TAE буфера для гель-электрофореза

Реагенты / Объем	1000 мл
Tris	242 г
Замороженная CH 3 COOH	57.1 мл
0.5 M EDTA (pH 8.0)	100 мл
H 2 O	Добавить до 1000 мл

Перед секвенированием генома, образцы также проходили масс-спектрометрию. Неопознанные виды были отправлены на секвенирование.

Обсуждение

Результаты секвенирования показали: помимо стандартных Aliivibrio logei и Photobacterium были обнаружены phosphoreumAliivibrio sifiae и Aliivibrio wodanis. Больший интерес представляет вид A. sifiae, вперве обнаруженный в 2007 году в Японском море как изолированная группа. A. sifiae, в отличие от A. logei и P. phosphoreum, светится не синим, а желтоватым светом. Интерес представляет путь миграции изолированного вида A. sifiae из Японского моря в Белое. Скорее всего, бактерии попали в иной ареал вместе с рыбой, внутри которой они развивались.

Вывод

– В кишечнике наваги, бычка, корюшки, зубатки, сельди и трески встречаются люминесцентные бактерии

– Все бактерии светятся одним цветом и с одинаковой интенсивностью.

Литература:

1. Журнал Популярная Механика «У Белого Моря был замечен светящийся снег
2. Люминисцентные биосенсоры на основе иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта фотобактерий Алескерова Л. Э.; Московский Государственный Университет имени М. В. Ломоносова Биологический факультет
3. Анализ люминесцирующей микрофлоры кишечника рыб студёных морей: Белого, Берингова и Охотского М. Н. Коноплёва, С. А. Хрульнова, М. С. Осетрова, Д. И. Дёгтев, И. В. Манухов, Г. Б. Завильгельский, г. Москва
4. Температурная зависимость lux-оперона Photorhabdus luminescens в клетках E. coli Фомин В. В.; Московский физико-технический институт (государственный университет) (МФТИ, г. Долгопрудный)
5. Aliivibrio wodanis as a production host: development of genetic tools for expression of cold-active enzymes — Jenny Johansson Söderberg, Miriam Grgic, Erik Hjerde & Peik Haugen, Microbial Cell Factories volume 18, Article number: 197 (2019)
6. Aliivibrio sifiae sp. nov., luminous marine bacteria isolated from seawater, Susumu Yoshizawa, The University of Tokyo, Hajime Karatani, Minoru Wada, University of Nagasaki, Akira Yokota January 2010, The Journal of General and Applied Microbiology