В последние десятилетия XX века актуальной проблемой научно-исследовательского сектора фармацевтической индустрии стала проблема формирования новых подходов к вопросу создания оригинальных лекарственных субстанций. В фармацевтической индустрии существуют два основных направления разработок — усовершенствование существующих и создание новых лекарственных средств.
Все большее внедрение в фармацевтическую отрасль современных технологий позволяет совершенствовать методы создания лекарственных средств. К таким методам следует отнести комбинаторную химию, компьютерное моделирование молекул, виртуальный скрининг, высокоэффективный панельный скрининг. Путем скрининга и случайных наблюдений в свое время были найдены ценные препараты, вошедшие в медицинскую практику. Впервые фармакологический скрининг применил немецкий ученый Герхард Домагк, который проводил поиск антимикробных средств среди соединений, синтезированных для крашения тканей. У одного из этих красителей — красного стрептоцида и было обнаружено противомикробное действие. Так были открыты сульфаниламидные средства. Проведение скрининга — это чрезвычайно трудоемкий и затратный процесс: для обнаружения одного лекарственного средства исследователю приходится тестировать несколько сотен или тысяч соединений. Так, Пауль Эрлих при поиске противосифилитических средств изучил около тысячи органических соединений мышьяка и висмута, и только один препарат — сальварсан (арсфенамин) оказался достаточно эффективным.
Скрининг биологической активности включает в себя следующие этапы:
1. Виртуальный скрининг;
2. Синтез вещества с заданной структурой;
3. Панельный скрининг.
Виртуальный скрининг — это процесс отбора соединений, которые имеются только в электронном виде. Метод виртуального скрининга основывается на том, что ожидаемая биологическая активность напрямую связана со структурой соединения. С помощью таких методов становится возможным предсказание биологической активности как уже имеющегося набора соединений, так и еще не существующих в природе веществ, т. е. еще до синтеза прогнозировать их действие на живые организмы. Например, производные хинолина обладают противотуберкулезной активностью; производные 2–8-бензилпиримидинов используются для создания антигистаминных лекарственных средств; производные 1,5-оксадиазола проявляют гипотензивное действие.
Виртуальный скрининг включает следующие этапы:
1. Подготовка модели биомишени (расстановка зарядов на атомах);
2. Подготовка баз данных структур органических соединений (расчет физико-химических свойств, моделирование пространственной структуры соединения, расчет зарядов на атомах);
3. Препроцессинг баз данных (процесс удаления структур по физико-химическим критериям: липофильности, молекулярной массе, по предсказанной токсичности и т. д.);
4. Молекулярный докинг — метод молекулярного моделирования, основанный на предсказании наиболее выгодного положения молекул в пространстве относительно друг друга;
5. Постпроцессинг сформированных баз потенциальных лигандов с помощью моделей QSAR, в результате чего мы получаем сфокусированную библиотеку потенциальных лигандов для данной биомишени.
QSAR — аббревиатура, которая является сокращением от английского Quantitative Structure Activity Relationships, что в переводе на русский язык обозначает Количественное Cоотношение Cтруктура — Активность (КССА). В методологии QSAR выделяют прямую и обратную задачи. Прямая задача QSAR заключается в предсказании активности на основе знания структуры соединения. Обратной задачей QSAR является конструирование химических структур с заданными величинами активностей. В методе QSAR структурная формула представляется в математическом виде- модели QSAR, с помощью которой можно описать как биологическую активность, так и любое свойство соединения. Модель QSAR представляет собой линейную зависимость свойство-структура. С помощью метода QSAR становится возможным синтез соединений с заданным комплексом свойств.
Помимо виртуального скрининга, основанного на поиске лигандов, существует виртуальный скрининг биологической активности с использованием фармакофоров. Фармакофор — структурный элемент или фрагмент молекулы, обеспечивающий фармакологическую активность соединения. Фармакофорная модель представляет собой набор точек в пространстве с определенными физико-химическими свойствами, местами связывания и расстояниями между ними. Виртуальный скрининг с использованием фармакофорной модели предполагает отбор молекул, удовлетворяющих требованиям данной модели относительно функциональных групп и расстояний между ними.
После подбора структуры соединения осуществляют синтез вещества, а затем проводят исследование его биологической активности с помощью панельного скрининга.
В 60-е годы ХХ века разработаны методы иммуноферментного анализа, с помощью которых проводился анализ одного образца на одном биочипе. Такой процесс занимал большое количество времени. В последующие годы технология изучения биологической активности совершенствовалась: изучалось 16 образцов, включенных в один планшет; планшеты объединили, и стало возможным изучение 64 образцов за раз. В настоящее время анализ биологической активности проводится на биочипе. Биочип — это матрица, на которую наносятся биологические макромолекулы, т. е. биомишени (ДНК, белки, в том числе и ферменты, клетки), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе. В качестве биомишеней могут выступать олигонуклеотиды, фрагменты геномной ДНК, РНК, белки, полипептиды, рецепторы антител, лиганды, олигосахариды и т. д. Биочип позволяет определить активность сразу 96 соединений (в отличие от ИФА). Матрицы для биочипа — это стеклянный или гелевый слайд (стандартного размера 25х75х1 мм). Биочипы объединяют в планшет, размеры которого неограничены.
Рассмотрим процессы определения биологической активности с помощью ИФА и анализа на биочипе.
Анализ биологической активности на иммуночипе начинается с этапа пробоподготовки путем разведения сыворотки. Затем проводят термостатирование и отмывку (для выделения участка или фрагмента молекулы). Добавляют анализируемое вещество, проводят термостатирование с конъюгатом, отмывку продукта и обработку результатов анализа. При проведении анализа с помощью биочипа отсутствуют стадии пробоподготовки, термостатирования и отмывки, т. е. на поверхность биочипа помещают уже готовую биомишень, затем добавляют вещества, биологическую активность которых необходимо изучить. Происходит связывание анализируемых веществ с биомишенью. Добавляют фосфоресцентный метчик, после чего испускается световой сигнал. По характеру свечения или его отсутствию судят о той или иной биологической активности. В качестве сигнальных реактивов или фосфоресцентных метчиков используют длительно люминесцирующие металлопорфирины и комплексоны ионов лантаноидов.
Преимущества использования биочипов в анализе биологической активности. Стоимость определения биологической активности с помощью биочипа в разы ниже, чем при использовании набора для ИФА. Использование биочипов в анализе биологической активности позволяет проанализировать одновременно большое количество соединений за короткий период времени. К недостаткам анализа с помощью биочипов следует отнести материал, из которого они изготовлены (гелевые биочипы подходят для анализа, в котором в качестве биомишеней выступает ДНК, но не белок, это связано с их структурой. Из-за этого возможны искажения результатов анализа).
Описанные методы дают возможность провести следующие доклинические испытания:
Провести исследования на биологическую активность:
1. Изучить токсичность, мутагенность, кардиотоксичность;
2. Исследовать анальгетическую активность;
3. Исследование протововоспалительной активности (влияние на эффекты медиаторов воспаления).
Изучить модели заболеваний:
1. Изучение модели заболевания: Болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона;
2. Изучение онкологических заболеваний (ксенографты);
3. Изучение поведенческих моделей: антидепрессантной, антипсихотической, каталептической, антиамнестической активностей
Также с помощью описанных методов можно изучить свойства веществ:
1. растворимость в воде;
2. липофильность (logP);
3. проницаемость через ГЭБ;
4. связывание с белками плазмы крови.
Предсказание направления активности соединений имеет особое значение, так как современная фармакология работает более чем с двумя тысячами видами биологической активности. Использование методов рационального досинтетического отбора является необходимым условием успешной реализации исследовательских программ по разработке новых лекарств.
Литература:
1. Böhm H.-J., Schneider G. Virtual screening for bioactive molecules / Weinheim: Wiley-VCH. — 2000.
2. Walters W. P., Stahl M. T., Murcko M. A. Virtual screening — an overview // Drug Disc. Today 1998. V. 3. P. 160–178.
3. Sun H. Pharmacophore-based virtual screening. Curr Med Chem. 2008; 15(10),
4. P. 1018–24.
5. Willett P. Chemical Similarity searching // J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1998. V. 38. № 6. P. 983–996.
6. Грицкова И. А., Марков А. Г., Станишевский Я. М., Быков В. А., Прокопов НИ., Хачатурян ИВ., Мягкова М. А., Каплун А. П. Исследование свойств полимерных микросфер различной природы, используемых при создании тест-систем для определения С-реактивного белка // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника, 2005, № 1–2, С. 69–75.
7. Brown R. D., Martin Y. C. Use of structure-activity data to compare structure-based clustering methods and descriptors for use in compound selection // J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1996. V. 36. № 3. P. 572–584.
