Состояние перекисного окисления липидов у овец, вызванных B. ovis

В статье приведены данные по исследованию клинико-патогенетических особенностей бруцеллеза мелкого рогатого скота вызванного B. ovis, с точки зрения окислительно-восстановительных процессов протекающих в организме больного животного. Изучены показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при бруцеллезе.

Ключевые слова: бруцеллез, каталаза, малоновый диальдегид, оксидативный стресс, B. ovis.

The article presents data on the study of clinical and pathogenetic features of brucellosis in sheep caused by B. ovis, in terms of oxidation-reduction processes occurring in the body of an infected animal. Studied lipid peroxidation and anti-oxidant system in brucellosis.

Key words:Brucellosis, catalase, malondialdehyde, oxidative stress, B. ovis.

Введение. Среди многих инфекционных заболеваний особенно большую угрозу для здоровья человека представляет бруцеллез. По данным Всемирной организации здравоохранения ежегодно бруцеллезом заболевают около 500 000 людей. Наряду с этим бруцеллез причиняет весьма значительные убытки животноводству. В Республике Казахстан бруцеллез регистрируется практически у всех видов сельскохозяйственных и домашних животных, но бруцеллез крупного рогатого скота является более значимым, как в эпизоотологическом, так и в экономическом аспекте. Система мер борьбы и профилактики с бруцеллеза крупного рогатого скота основана на диагностике, профилактике и организации специальных мероприятий, которые позволяют предотвратить дальнейшее распространение болезни, снизить количество неблагополучных пунктов и сократить случаи заражения людей бруцеллезом.

В клинической практике диагностики многих инфекционных заболеваний возрос интерес к проблеме перекисного окисления липидов в мембранах клеток [1, с. 40].

При нарушениях механизмов регуляции процессов свободно радикального окисления, сопровождающихся избыточным накоплением радикалов, могут значительно повреждаться биомембраны, что в настоящее время признается универсальной неспецифической основой патогенеза самых различных заболеваний [2, с. 902].

Постоянное образование прооксидантов в живых организмах уравновешено их дезактивацией антиоксидантами, поэтому для поддержания гомеостаза необходима непрерывная регенерация антиоксидантной способности. Отсутствие или сбой этой непрерывности сопровождается накоплением окислительных процессов и заболеваний, таких как воспаление, реперфузионное заболевание, старение, канцерогенез и др. [3, с. 9].

В плане же изучения биохимических механизмов, лежащих в основе нормальной жизнедеятельности организма и нозологически дифференцируемой патологии, в настоящее время все большее внимание исследователей привлекают процессы перекисного (свободнорадикального) окисления липидов (ПОЛ) и состояние системы антиоксидантной защиты (АОЗ) организма, в связи с признанием их решающей роли в регуляции структурно-функциональных свойств биомембран, которые являются определяющими в переходе клетки и организма в целом из одного метаболического состояния в другое. Снижение уровня антиоксидантов приводит к патологическому эффекту воздействия продуктов перекисного окисления липидов. Одним из самых значимых вторичных продуктов ПОЛ является малоновый диальдегид (МДА/MDA), на долю которого приходится 40 % всех карбонильных соединений. Отмечается повышение уровня МДА при многих инфекционных заболеваниях. А одним из значимых компонентов АОС является каталаза (CAT) — гемсодержащий фермент, преимущественно находится в пероксисомах, где образуется наибольшее количество перекиси водорода, а также в лейкоцитах, где она защищает клетки от последствий «респираторного взрыва». В основе антиоксидантного действия каталазы лежит реакция разложения перекиси водорода, которая может инициировать образование самой активной формы окиси водорода [4, с. 99].

На сегодняшний момент для дифференциации различных видов бруцелл используются их антигенные, культурально-биохимические и бактериологические свойства, но большинство современных исследований по видоидентификации различных организмов основываются на методах молекулярной биологии, который позволяет типизировать по маркерному набору зашифрованного в молекуле ДНК. Одним из таких методов является ПЦР (полимеразно-цепная реакция). ПЦР является одной из наиболее эффективных технологий в молекулярной биологии. ПЦР в режиме реального времени позволяет измерять количество амплифицированных фрагментов искомой ДНК непосредственно в реакционной смеси во время и после окончания реакции. Метод основан на использовании молекул, способных флюоресцировать при определенной длине волны. Большинство коммерческих наборов позволяют определить участок генома характерный для всего рода Brucella, а для эпизоотологических и эпидемиологических целей иногда требуется выявить непосредственно вид бруцелл [5, с. 297].

Целью исследований явилось определение некоторых компонентов перекисного окисления липидов у овец при бруцеллезе вызванным B. ovis. Для достижения цели нами были определены следующие задачи:

-        Подобрать праймеры строго специфичные для Brucella ovis и оптимизировать условия ПЦР в режиме реального времени.

-        Исследовать содержание внутриклеточного антиоксиданта каталазы эритроцитов при бруцеллезе;

-        Определить уровень содержания малонового диальдегида в плазме крови.

Материалы и методы

Работа выполнялась на базе Научно-исследовательского института биотехнологии и природопользования (лаборатория биотехнологии инженерного профиля) ЗКАТУ имени Жангир хана. Проведение полимеразной цепной реакции осуществлялось на амплификаторе iQ5 фирмы BioRad. Выделение ДНК проводили с помощью комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала «АмплиПрайм ДНК-сорб-В», каталожный № 103–20. Подбор праймеров проводили согласно литературным данным и на основе компьютерного анализа при помощи пакета программ Vector NTI. Видоидентифицирущую способность праймеров определяли с помощью инструмента «Blast» (http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/).

Объектами исследования явились эритроциты 10 больных бруцеллезом овец (n=10), по результатам РБП проведенных в ЗК филиале РВЛ. В качестве контроля были взяты эритроциты от 10 здоровых овец.

Определения гемоглобина (Hb) проводили по методике Salvati A. M.et all, 1981, активность каталазы (CAT) по методу Aebi H, 1984, определения уровня малонового диальдегида (MDA) определяли по Gutterige J. M. 1995.

Измерения уровня концентраций CAT и MDA проводили на спектрофотометре CARY-50 согласно инструкции по его эксплуатации. Определение концентрации каталазы измеряли в динамике на спектрофотометре при длинне волны 240 н.м. в течении 3-х минут. Уровень малонового диальдегида определяли на зеленом светофильтре при длине волны 530–540 нм.

Результаты исследований и их обсуждение

В ходе проведенных исследований по подбору строго специфичных праймеров для видоидентификации бруцелл вида B. ovis были подобрана пара праймеров Bo si F (5’- TGA……ATA-3’) и Bo si R F (5’-TGA……AGG-3’).

При проведении анализа на видоидентифицирующую способность подобранных праймеров была определена строгая специфичность Bo si для B. ovis, согласно данным Национального центра биотехнологической информации США данная пара праймеров идентифицирует B. ovis штамм ATCC 25840 идентификационный номер CP000709.1.

В ходе проведенных исследований были определены показатели каталазы (Таблица 1).

Таблица 1

Уровень гемосодеожащегося фермента каталазы в контрольной и исследуемой группе

Полученные данные указывает на активизацию антиоксидантной защиты в результате развития бруцеллезной инфекции, о наличии развития оксидативного стресса говорит повышения уровня малонового диальдегида примерно в 8 раз (Таблица 2).

Таблица 2

Концентрация малонового диальдегида в эритроцитах овец в контрольной и исследуемой группе

Как видно из таблицы 2, в крови больных бруцеллезом животных значительно возросло образование продукта окисления липидов каталазы, это явно указывает на тот факт, что идет развитие патогенеза и АОС не способна держать в нормальных пределах уровень малонового диальдегида что несомненно приведет к развитию оксидативного стресса а вследствие усиление патогенетического воздействия бруцелл. Это связано с тем, что после попадания в организм бруцеллы подвергаются фагоцитозу, зачастую незавершенному. Активированный кислород — основной продукт фагоцитоза, с которым связано образование воспалительного очага.

Выводы

Таким образом в ходе исследований выявлен дисбаланс антиоксидантной системы у больных бруцеллезом овец вызванных B. ovis, проявляющийся в компенсаторном повышении уровня активности внутриклеточного антиоксиданта каталазы в эритроцитах. У больных бруцеллезом овец наблюдается активация перекисного окисления липидов с закономерным повышением уровня малонового диальдегида в плазме крови. Закономерные изменения показателей прооксидантной системы и антиоксидантной защиты организма можно использовать в качестве дополнительного критерия патогенеза бруцеллеза.

Литература:

1.      Иванов Н. П. Методологические основы борьбы с бруцеллезной инфекцией в современных условиях. // Научно-практический журнал Ветеринария. — 2008. — № 1. — С. 40–45.

2.      Gutteridge J. M. C., Beard A. P. C., Quinlan G. J. Superoxide-dependent lipid peroxidation. Problems with the use of catalase as a specific probe for feuton-derived hydroxyl radicals //Biochem. Biophys. Res. Commun.-1983.-V.l 17, N3- P.901–907.

3.      Зенков Н. К., Ланкин В. З., Меныцикова Е. Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. // МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001. — 343 с.

4.      Turk, R., Juretic, D., Gereš, D., Svetina, A., Turk, N., Flegar-Meštric, Z. Influence of oxidative stress and metabolic adaptation on PON1 activity and MDA level in transition dairy cows// Anim Reprod Sci. — 2008. — № 108 — P. 98–106.

5.      Foster J. T., Okinaka R. T., Svensson R., Shaw K., De B. K., Robison R. A., Probert W. S., Kenefic L. J., BrownW.D., Keim P. Real-time PCR assays of single-nucleotide polymorphisms defining the major Brucella clades. // J. Clin. Microbiol. — 2008. — № 46. — P. 296–301.

6.      Типы конституции сельскохозяйственных животных и их использование в селекционно-племенной и технологической работе / Л. А. Танана, Н. Н. Климов, С. И. Коршун, Е. Я. Лебедько, С. А. Козлов: Учебное пособие. — Брянск: Издательство Брянской ГСХА, 2014. — 212 с.