Иммуногистохимическое исследование эндометрия как метод мониторинга в программах подготовки эндометрия у женщин с неудачами вспомогательных репродуктивных технологий в анамнезе

Введение

Проблема бесплодия имеет медицинское, социально-демографическое и экономическое значение в большинстве развитых стран мира. Ежегодно в мире регистрируется 2–2,5 млн. новых случаев мужского и женского бесплодия [9,11, 24].

Изучение факторов бесплодия в браке различными авторами показало, что почти у каждой второй семейной пары (44,3–52,7 %) бесплодие обусловлено заболеваниями органов репродуктивной системы женщины, у 6,4–19,4 % семей — в результате патологии репродуктивной функции мужчины, а более трети семье (34,2–38,7 %) имеют бесплодие, обусловленное патологией репродуктивной функции обоих супругов [8, 12].

Для преодоления бесплодия в рамках вспомогательных репродуктивных технологий используется экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) преовуляторных ооцитов и переноса дробящихся эмбрионов в полость матки пациентки [9,3,1].

Однако реальная эффективность программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) не превышает 30–40 %.Пациентки с многократными неудачными программами вспомогательных репродуктивных технологий составляют около 30 % от всех пациентов, которые лечатся с использованием этих методов.Это связано с большим разнообразием факторов, влияющих на результат имплантации после пересадки эмбриона. Все факторы, связанные с неудачами имплантации можно разделить на две группы: качество эмбриона и состояние эндометрия. По данным H. Achache в 2/3 случаев неудачи ЭКО связаны с нарушением рецептивности эндометрия и имплантации. Неадекватная рецептивность эндометрия ответственна приблизительно за две трети неудач имплантации, тогда как эмбрион — только за одну треть [17, 4].

Роль патологии эндометрия в патогенезе бесплодия несомненна. Ведь именно адекватное морфофункциональное состояние эндометрия является одним из основных факторов, обеспечивающих успешную имплантацию оплодотворенной яйцеклетки и развитие эмбриона [14,16,25,26].

«Золотым стандартом» и окончательным этапом диагностики состояния эндометрия является морфологическое исследование эндометрия. Однако, рандомизированные контролируемые исследования показали еще несколько лет назад, что гистологическое исследование эндометрия не является достоверным методом для оценки недостаточности лютеиновой фазы и вообще для того чтобы каким-либо образом влиять на выбор тактики лечения бесплодия и не должно использоваться в качестве рутинного метода диагностики бесплодия [22,19]. Поэтому в настоящее время усилия направлены на разработку иных методов методов исследование эндометрия, в частности экспрессии ряда генов в эндометрии в период «окна имплантации», т.н. оценку «рецептивности эндометрия» [23,6].

Исходя из вышеперечисленного, целью нашей работы явилось использование иммуногистохимического метода оценки рецепторного аппарата эндометрия в процессе подготовки разнородной когорты пациенток после неудач программ ВРТ.

Материалы и методы обследования

Обследованы 82 женщины с бесплодием, вступающие в программу ВРТ с неудачами ЭКО в анамнезе. Критериями включения в основную группу (ОГ) было отсутствие беременности после программ ВРТ при удовлетворительном качестве перенесенных эмбрионов. Пациентки ОГ были разделены на две подгруппы: ОГ-1 и ОГ-2. В ОГ-1 вошли пациентки с трубноперитонеальной формой бесплодия; в ОГ-2 — пациентки, которые являлись носителями полиморфизма генов тромбофилий.

Контрольную группу (КГ) составили женщины (41 чел.), планирующие наступление беременности (в период предгравидарной подготовки), не использующиеся ВМС и гормональной контрацепцией, и имеющие отклонения в состоянии эндометрия по результатам ультразвукового обследования. У пациенток ОГ и ГС исследовались биоптаты функционального слоя эндометрия, взятые на 20–24 день овуляторного менструального цикла, в период «окна» имплантации. В дальнейшем проводилось патоморфологическое исследование биоптата, а также выполнялось иммуногистохимическое (ИГХ) исследование маркеров рецептивности стромы и желез эндометрия Ki 67, PCNA, полуколичественное определение рецепторов к эстрогену и прогестерону. После оценки инфекционного статуса пациенток, морфологического и иммуногистохимического исследования, в зависимости от полученных результатов была проведена комплексная терапия. Вкомплекс проводимых мероприятий для ОГ-1 была включена этиотропная антибактериальная, противовирусная терапия, коррекция гормональных нарушений (норгестрел + эстрадиола валерриат); для группы ОГ-2-профилактическое назначение антитромботических средств (дипиридамол, надропарин кальция). Кроме того, все пациенткам ОГ были назначены в зависимости от иммунного статуса иммуномодуляторы (тилорона дегидрохлорид, азоксимера бромид, интерферон человеческий рекомбинантный альфа-2), витаминные комплексы, метаболические препараты (пентоксифиллин, дипиридамол, сухой водный экстракт свежих листьев артишока полевого) физиолечение (на аппарате «Андрогин») а также пробиотики. Контроль эффективности терапевтических мероприятий проводился через 6 месяца у пациенток ОГ.

Статистическая обработка данных выполнена с применением прикладных программ для статистической обработки «Excel 7.0», раздел «Анализ данных», подразделение «Описательная статистика» и «Statistika 6.0»..Для оценки динамики среди параметрических зависимых данных использовался попарный критерий Стьюдента. Для анализа качественных независимых использовали критерий Пирсона (х2), либо точный критерий Фишера

Результаты исследования и обсуждения

Пациентки ОГ и ГС были сопоставимы по возрастному критерию (до 35 лет). Средний возраст пациенток в ОГ-1 составил 34,3±2,56 года; в ОГ-2–32,4±2,39 года; в КГ — 31,04±2,36 (р>0,05). При исследовании гормонального профиля у пациенток ОГ и ГС средние показатели эстрадиола и прогестерона в группах не имели достоверных различий и находились в пределах референсных значений данного репродуктивного возраста.

Морфологическое исследование эндометрия выявило патологические изменения у всех пациенток ОГ-1. Наиболее часто она была представлена хроническим эндометритом (инфильтраты лимфоидных клеток, плазматические клетки, склеротические изменения стенок спиральных артерий) — 19 (23,17 %) пациенток в группе ОГ-1, что совпадает с данными ряда исследователей [11]. В группе ОГ-2 у 5и пациенток отмечены склеротические изменения стенок спиральных артерий при отсутствии воспалительных изменений. В этой же группе выявлено достоверно большее количество пациентов с НЛФ — 10 (24,39 %) чем в ОГ-1 (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика морфологического исследования эндометрия у пациенток ОГ и ГС (абсол.число/ %)

Параметры исследования	ОГ-1, n=41	ОГ-2, n=41	КГ, n=41	р
Воспалительные изменения —инфильтраты лимфоидных клеток очаговые —инфильтраты лимфоидных клеток диффузные —наличие в строме плазматических клеток	15 36,5 % 10 24,39 % 8 19,5 %	2 4,87 % 1 2,43 % 2 4,87 %	- 1 2,43 % 1 2,43 %	р <0,01 (c2 =10,68) р <0,01 (c2 =6,71) р1 <0,01 (c2 =6,71) р1 <0,05 (c2 =4,49)
Склеротические изменения стенок спиральных артерий	21 51,21 %	8 19,5 %	-	р <0,01 (c2 =7,68)
НЛФ	8 19,5 %	10 24,39 %	-
Гиперплазия эндометрия	7 17,07 %	6 14,63 %	2 4,87 %
Полипы эндометрия	5 12,16 %	3 7,31 %*	-
Атрофия эндометрия	3 7,31 %	1 2,43 %**	-

Примечание: р –достоверные различия показателей между группами ОГ₁-ОГ₂; Р1- достоверные различия показателей между ОГ₁-КГ, р₂- достоверные различия показателей между ОГ₂-КГ; р˂ 0,05(95 % уровень значимости),р≤0,01(99 % уровень значимости) — разность показателей статистически значима

Ряд исследователей женщин с привычным невынашиванием беременности и высоким риском инфекционных осложнений описывают бессимптомное течение воспалительного процесса в эндометрии, сопровождающегося нарушением экспрессии рецепторов половых стероидных гормонов [18;20;21].

В ОГ-1 отмечалось достоверное увеличение индекса экспрессии ЭР (12,3±5,4 %) в строме по сравнению с аналогичными показателями у пациенток ОГ-2 (7,6±2,2 %) и КГ (8,2±2,6 %). При этом у пациенток КГ регистрировались самые низкие показатели экспрессии ЭР (р˂0,01)(табл.4). Экспрессия прогестероновых рецепторов в ОГ-1 и ОГ-2 была существенно понижена в строме, в то время как в железах она мало отличалась от КГ. При анализе экспрессии ПР отмечено выраженное угнетение рецепторного аппарата в стромальном компонентеупациенток ОГ-1 — индекс экспрессии — 6,4±3,7 % и ОГ-2 10,5±6,8 %, по сравнению с аналогичными данными КГ -14,3±7,2 % (р˂0,05), что подтверждает данные исследований В. С. Бессмертной [2]. Отмечалось и снижение данного показателя в ОГ-1 в железистом эпителии — 9.5±3,6 против 12,8±6,8 КГ (табл.4). Некоторые авторы [15] полагают, что у пациенток, страдающих трубно-перитонеальным бесплодием, существует гормональная недостаточность яичников, связанная с низкими количеством и/или чувствительностью рецепторов эстрогенов и прогестерона в эндометрии, и указанные изменения рецептивности эндометрия у женщин с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе могут явиться причиной неудач последующих циклов ВРТ. В исследованиях Котикова А. Р. ИГХ анализ эндометрия женщин, страдающих бесплодием неясного генеза и привычным невынашиванием беременности при ХЭ, выявляетпостоянно встречающийся признак в виде взаимозависимого снижения сродства к прогестерону рецепторов железистых и стромальных клеток эндометрия в обеих фазах менструального цикла со значительным снижением данного показателя в фазу секреции [7].Ожидаемо отмечено повышение пролиферативной активности в основной группе пациенток. Особенности в пролиферативной активности обнаружены и между пациентками с бесплодием. Показатели экспрессии Кi67 и PCNA у женщин ОГ-1 превосходили (р<0,05; р<0,01) аналогичные показатели у пациенток ОГ-2 как в строме, так и в железистом эпителии (табл. 2).

Таблица 2

Характеристика пролиферативных процессов в эндометрии у пациенток ОГ и КГ (% позитивно окрашенных ядер)

	ОГ-1, n=41		ОГ-2, n=41		КГ, n=41
	Строма	железистый эпителий	Строма	железистый эпителий	Строма	Железистый эпителий
Ki 67	7,5±3,8 t=0.88	6,5±2,4 t3 =1.42 р˂0.01	3,9±1,5 t2 = 0.35	2,6±1,3 t5=1.32	3,3±0,8 t1=1.08	0,8±0.4 t4 =2.34 р˂0.01
PCNA	7,2±4,1 t=0.60	5,4±2,1 t3 =0.53	4,6±1,3 t2 = 0.29	4,0±1,6 t5=-0.1	4,1±1,1 t1= 0.73	4,2±0,9 t4 =0.52

t — парный критерий Стьюдента ОГ₁-ОГ₂ строма; t₁ — парный критерий Стьюдента ОГ₁-КГ строма; t₂– парный критерий Стьюдента ОГ₂-КГ строма; t3 –парный критерий Стьюдента ОГ₁-ОГ₂ эпителий; t4 –парный критерий Стьюдента ОГ₁-КГ эпителий; t5 –парный критерий Стьюдента ОГ₂-КГ эпителий.

Повышение при ХЭ экспрессии маркера пролиферации клеток Ki-67 является доказательством усиления процессов пролиферации клеток эндометрия и их апоптоза, особенно в поверхностных слоях [18;20;21].

Через 6 месяцев комплексной терапии в основной группе отмечено достоверное (р<0,01) снижение числа воспалительных элементов. В ОГ-2 воспалительных элементов не выявлено. Отставание желез в развитии (НЛФ) значительно уменьшилось как в ОГ-1, так и в ОГ-2 (р<0,05) (табл.3). В рецепторном аппарате пациенток обследуемых групп тоже произошли выраженные изменения. Более всего изменения были заметны в строме, и не выражено — в железах (табл.4).

Таблица 3

Морфологическое состояние эндометрия на фоне проводимой терапии

Параметры исследования	ОГ-1, n=41		ОГ-2, n=41
	Исходно	Через 6 месяцев	Исходно	Через 6 месяцев
Воспалительные изменения —инфильтраты лимфоидных клеток очаговые —инфильтраты лимфоидных клеток диффузные —наличие в строме плазматических клеток	15 36,5 % 10 24,39 % 8 19,5 %	2 4,87 % р<0,01 c2 =10,68 1 2,44 % р<0,01 c2 =6,71 —	2 4,87 % 1 2,43 % 2 4,87 %	- — —
Склеротические изменения стенок спиральных артерий	21 51,21 %	3 7,32 % р<0,001 c2 =17,02	8 19,5 %	1 2,44 % р<0,05 c2 =4,49
НЛФ	8 19,5 %*	1 2,44 % р<0,05 c2 =4,49	10 24,39 %*	1 2,44 % р<0,01 c2 =6,71
Гиперплазия эндометрия	7 17,07 %	-	6 14,63 %	-
Полипы эндометрия	5 12,16 %	-	3 7,31 %*	-
Атрофия эндометрия	3 7,31 %	-	1 2,43 %**	-

Примечание: р –достоверные различия показателей внутри группы до и после терапии

Таблица 4

Состояние рецепторного аппарата на фоне проводимой комплексной терапии

		ОГ-1, n=41		ОГ-2, n=41		КГ, n=41
		Исходно	Через 6 месяцев	Исходно	Через 6 месяцев
Индекс ЭР (%)	строма	12,3 ± 5,4	10,1 ±3,2 t=0,35	7,6±2,2	7,2 ±2,1 t=0,13	8,2± 2,6
	железистый эпителий	9,6±4,9	9,1 ±4,2 t=0,07	5,6±3,2	5,5 ±3,2 t=0,02	6,8±3,5
Индекс ПР (%)	строма	6,4±3,70	11,2 ±5,4 t=-0,73	10,5±5,8	13,5 ±7,1 t=-0,33	14,3±7,2
	железистый эпителий	9,5±3,6	10,3 ±4,3 t=-0,14	10,0 ±4,3	10,6 ±4,4 t=-0,09	12,8±6,8
ЭР/ПР	строма	1,9	1,2	1,8	1,1	0,8
	железистый эпителий	1,04	1,0	0,56	0,56	0,6

Проведенное повторно иммуногистохимическое исследование характеризовалось снижением интенсивности процессов пролиферации. В обеих группах отмечено снижение экспрессии ядерного белка Ki67, PCNA. Состояние интенсивности процессов апоптоза эпителия и клеток стромы эндометрия достоверно значимо произошло только у пациенток ОГ-1, преимущественно в железистом эпителии (табл.5,6).

Таблица 5

Характеристика пролиферативных процессов в эндометрии у пациенток ОГ на фоне проводимой терапии(% позитивно окрашенных ядер).

	ОГ-1, n=41
	Исходно		После терапии
	Строма	Железистый эпителий	Строма	Железистый эпителий
Ki 67	7,5±3,8	6,5±2,4	3,8±1,1 t=-0.93	2,3±1,1 t1=-1.59
PCNA	7,2±4,1	5,4±2,1	3,1±1,2 t=-0.95	4,2±1,8 t1=0,39

Примечание: t — парный критерий Стьюдента строма до и после терапии; t1 — парный критерий Стьюдента железистый эпителий до и после терапии

Таблица 6

Характеристика пролиферативных процессов в эндометрии у пациенток ОГ-2 на фоне проводимой терапии (% позитивно окрашенных ядер).

	ОГ-2, n=41
	Исходно		После терапии
	Строма	Железистый эпителий	Строма	Железистый эпителий
Ki 67	3,9±1,5	2,6±1,3	3,1±1,2 t=-0,41	2,5±1,1 t1=-0,05
PCNA	4,6±1,3	4,0±1,6	4,0±1,1 t=-0,35	4,5±1,2 t1=-0,05

Примечание: t — парный критерий Стьюдента строма до и после терапии; t1 — парный критерий Стьюдента железистый эпителий до и после терапии

Но даже в «окне имплантации» естественного цикла данные об экспрессии стероидных рецепторов отличаются у разных исследователей, что во многом связано с использованием различных систем количественной оценки [5,10]. Важен не только уровень половых стероидов в организме, но и сохранение всех путей реализации гормонального эффекта, в чем решающую роль играет количество функционально полноценных рецепторов ткани эндометрия к соответствующим стероидным гормонам [13].

Выводы

1.         При морфологическом исследовании пациенток с бесплодием выявлены патологические изменения, при этом в группе женщин с трубно-перитонеальным бесплодием преобладал хронический эндометрит (р<0,01), а у пациенток носителей наследственных тромбофилий доминировала НЛФ.

2.         Выявлена достоверная тенденция (р<0,01) у пациенток ОГ-1 к увеличению уровня ЭР и угнетению ПР, в сравнении в КГ.

3.         Уровень пролиферативной активности был достоверно выше (р<0,05; р<0,01) у пациенток ОГ-1, что может свидетельствовать о наличии неполноценного «окна имплантации».

4.         Иммуногистохимический метод может быть использован в качестве метода мониторинга состояния эндометрия у пациенток с неудачами ЭКО в анамнезе.

Литература:

1.                  Амирова А. А. Прогнозирование исходов ЭКЭ и ЭКО/ИКСИ у бесплодных супружеских пар при некоторых формах бесплодия. Авторефер.канд…мед.наук.-Москва.- 2011.-26 с.

2.                  Бессмертная В. С., Самойлов М. В., Серебренникова К. Г. Морфологические и иммуногистохимические особенности эндометрия женщин с первичным и вторичным бесплодием // Архив патологии. — 2008.-Т.70.-№ 4 C. 31–34.

3.                  Вартанян Э. В., Мартышкина Е. Ю., Цатурова К. А. Роль сочетанной патологии в неудачных протоколах ЭКО // Акушерство, гинекология, репродукция.-2011.-Т.5,№ 4.-С.40–43.

4.                  Гюльмамедова И. Д. Проблемы имплантации в программе IVF // Новости медицинской фармации. Гинекология. — 2008. — № 253. — С. 17–27.

5.                  Евдоченко И. И. Экспрессия рецепторов стероидных гормоновэндометрия и состояние локального иммунногостатуса при эндокринном бесплодии у женщин: автореф. дис. … канд. мед. наук. / И. И. Евдоченко. –Томск,2004.-26 с.

6.                  Ковязин В. А. Иммуногистохимическое исследование экспрессии факторов апоптоза и рецепторов к стероидным гормонам в эндометрии при нормальном менструальном цикле // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. -2006.- Том 5, № 2.- С. 12–17.

7.                  Котиков А. Р. Патологическая анатомия и иммуногистохимический анализ эндометрия женщин с бесплодием неясного генеза и привычным невынашиванием беременности при хроническом эндометрите: Автореф. дис. канд. мед. наук.- Москва, 2009.-24 с.

8.                  Корнеева И. Е. Современная концепция диагностики и лечения бесплодия в браке: Автореф. дис… д-ра мед. наук. -Москва,2003.- З6.с.

9.                  Кулаков В. И. Гинекология. Национальное руководство / М.:ГЭОТАР-Медиа, 2007.-С.890–897.

10.              Ншанян С. Ю. Диагностика и лечение структурно-функциональных нарушений эндометрия у женщин с бесплодием: Авторефер. дис… канд. мед. наук. — Москва, 2004. — 35 с.

11.              Овсянникова Т. В., Макаров И. О.,Камилова Д. П. Бесплодный брак: принципы диагностики и лечения //Акушерство, гинеклогия.-2012.-№ 1.- С.7–9.

12.              Рудакова,Е. Б. С.И. Семенченко С. И., Панова О. Ю. [и др.] Инфекционная патология нижнего отдела половых путей женщины и бесплодие (обзор литературы) / //Гинекология.- 2004. -Т.6.№ 3. С.132–135.

13.              Светлаков, A. B. Яманова М. В., Салмина А. Б. [и др.] Вероятность наступления имплантации у женщин с разными формами бесплодия при лечении методом ЭКО // Проблемы репродукции.- 2002.- № 3.- С. 61–66.

14.              Сейдахметова Ж. К. Состояние эндометрия при эндокринном факторе бесплодия: Авторефер.канд…мед.наук./.- Бишкек, 2011.-24 с.

15.              Серов В. Н. Репродуктивное здоровье женщин России: Актуальные направления исследований в области репродуктивного здоровья женщины /В. Н. Серов //Международный симпозиум. –М., 1997.- С. 5–6.

16.              Феоктистов А. А., Овсянникова Т. В., Камилова Д. П. Роль хронического эндометритат в клинике женского бесплодия // «Эффективная фармакотерапия». Акушерство и гинекология.-2012.-№ 1.-С.10–13.

17.              Achache H. Endometrium receptivity markers, the journey to successful embryo implantation / H. Achache, A. Revel // Hum Reprod Update.-2006.-V.12(6).- P.731–746.

18.              Cicicnel H. E., De Ziegler D., Nicoletti R., Cicicnel Н. Е. [et al.] Chronic endometritis correlation among histeroscopie, histologic, and bacteriologicfindings in a prospective trail with 2190 consecutive office gysteroscopies //.Fertil Steril.- 2008.-Vol. 89.№ 3.- Р.677–684.

19.              Coutifaris C., Myers E. R., Guzick D. S. [et al.] // Histological dating of timed endometrial biopsy tissue is not related to fertility status// Fertil. and Steril.-2004. -Vol. 82. -P. 1264–1272.

20.              Imamov О., Shim G. J., Warner М. [et al.] Estrogen receptor beta in health and disease // Biol Reprod.-2005.-vol.73., № 7 -P.866–871.

21.              Kayisli U. A., Guzeloglu-Kyisli О., Arici А. Endocrin-immune interaction in human endometrium // Ann N Y Acad Sei.- 2004; 1034: Р.50–63.

22.              Murray M.J, Meyer W. R., Zaino R. J. A critical analysis of the accuracy, reproducibility, and clinical utility of histologic endometrial dating in fertile women // Fertil Steril.- 2004; V.81.-P.1333–1343.

23.              Pellicer A., Bravo М. С., Madero R. [et al.] Early systemic hypotension and vasopressor support in low birth weight infants: impact on neurodevelopment // Pediatrics. -2009.-V. 123(5).-P.1369–7666.

24.              Reddy U. M., Wapner R. J., Rebar R. W. [et al.] Infertility, assisted reproductive technology, and adverse pregnancy outcomes: Executive summary of a National Institute of Child Health and Human Development workshop // Obstet Gynec.-2007.- № 109.-Р. 967–977.

25.              Ross J. D. C. What is endometritis and does it require treatment? // Sex. Transm. Inf. 2004. — Vol.80. — P. 252–253.

26.              Samoylov, M. Serebrennikova К., Bessmertnaya V. [et al]. Endometrial window of implantation in infertility // Histopathology. — 2008 — Vol.53 — Suppl.1 — Р.200–201.