В данной публикации рассматривается вопрос использования вероятностно-статистических приемов в исследовании слизистой оболочки полости рта и возможность достоверной интерпретации полученных результатов.
Ключевые слова: клиническая гистохимия, слизистая оболочка полости рта, щипковая биопсия, метаболический профиль
В понятие «клиническая гистохимия» входит спектр методологических приемов, предназначенных для идентификации содержания метаболитов, уровня активности ферментных систем в материале «щипковых» биопсий.
Конечным этапом анализа является способ формализации результатов исследования гистохимического микропрепарата биопсии и получение в документированном виде характеристик гетерогенности, топохимии, «метаболического профиля». Основным приемом исследования является светооптическая микроскопия, основанная на использовании криостатной техники, методов адекватной фиксации и подготовки материала, способе изучения микропрепаратов, а также достоверной его оценки.
Эпителиальный пласт слизистой оболочки полости рта — десны, твердого неба, щеки — интегрированная клеточная совокупность, вектор дифференцировки которой направлен от базальной мембраны к поверхности эпителиоцитов. Процедуры получения гистохимического микропрепарата предполагают использование приемов, препятствующих температурным, химическим, физическим, осмотическим изменениям микроструктур с момента получения биопсии. Быстрая остановка обменных процессов и необратимое ингибирование, приводящих к аутолизу ткани ферментов, достигается охлаждением до -70°C.
Имеются специальные подходы в снижении температуры биопсии. Необходимо использовать в качестве теплоотвода жидкие среды, которые предотвращают кристаллизацию внутриклеточной воды и повреждение микроструктур. Обычно для этого используются петролейный эфир, фреоны или высокооктановый бензин. Биоптат погружается в жидкость, ёмкость с которой опускается в жидкий азот. Полное замерзание материала контролируется визуально или после просмотра серии пробных срезов. В камере криостата при температуре от -18 до -20°С приготовляются срезы, которые обрабатываются дифференцированно с учетом последующих исследований. Для выявления гликогена срезы фиксируются в течение 40 мин в смеси Россмана при температуре -18°С; нейтральных гликопротеинов белка, рибонуклеиновой кислоты, ДНК — пропаноле при комнатной температуре; сульфатированных и кислых гликопротеинов клеток, протеогиалуронатов интерстиция в растворе цетилпиридихлорида в 5 % нейтральном формалине в течение 16–18 часов при 4°С. В качестве выбора может быть использован фиксатор Конклина — 2 % раствор ацетата калия (натрия) в 10 % нейтральном формалине на холоду. Активность ферментов изучается при различных способах подготовки материала. Гистохимия дегидрогеназ требует немедленной после резки инкубации срезов, кислой и щелочной фосфатазы стабилизации мембран в смеси ацетона и хлороформа при 4°С в течение 3 минут. Необходимые для морфологической верификации методики окрашивания также могут выполняться после фиксации криостатных срезов, однако при этом следует принять во внимание различия микроскопических картин, что выявляется после сопоставления с микропрепаратами, полученными окрашиванием парафиновых срезов.
Этап визуализации активности ферментов, содержания метаболитов предусматривает процедуры сохранения прижизненной топохимии дегидрогеназ или таких легкоподвижных в цитоплазме соединений, как гликоген. Необходимо также учитывать возможность растворения биополимеров в фиксирующих жидкостях и смесях. Такие потери представляются существенными, если исследование связано с нейтральными гликопротеинами структур базальной мембраны или гликокалекса плазмолеммы. Если этапы подготовки проведены правильно, необходимо учитывать максимально возможное разрешение методики.
Для этого устанавливаются режимы окрашивания срезов методами, рассчитанными на блокаду конкурентных соединений, реагентами с повышенной чувствительностью. При исследовании активности ферментов используются гель-среды на основе поливинолового спирта, подбираются концентрации кофакторов и нитро-СТ, препятствующие растворению ферментативного белка, недегидрогеназным эффектам, снижению разрешения методов в связи с высокой концентрацией субстрата.
Гистохимические микропрепараты представляют собой композицию из окрашенных хромофорных упаковок с равномерным распределением хромофора в каждой из них, распределенных на непоглощающем свет фоне. В физическом смысле этот объект обладает светооптическими и спектральными характеристиками, пространственно организован в средах с различными оптическими константами.
Если принять перечисленные требования к выполнению, становится возможным исследование гистохимического микропрепарата с помощью автоматизированных микротелевизионных средств для получения данных о гетерогенности метаболических характеристик совокупности эпителиоцитов, вида физиологического градиента содержания метаболитов и активности дегидрогеназ, «метаболического профиля». Первичным этапом формализации свойств совокупности эпителиоцитов слизистой оболочки полости рта является статистический анализ на основе статистико-вероятностных подходов: определение законов распределения исследуемого признака совокупности, классификации совокупности, временных характеристик модели, выявление принципов внутренней саморегуляции.
Вероятно-статистическая оценка осуществляется с использованием пакета «Статистика-Р». Документирование на этом этапе осуществляется получением статистической таблицы, в которую входят данные о среднем арифметическом, его ошибке, среднем квадратичном отклонении, коэффициентах вариации Пирсона, асимметрии и эксцесса. Программа дает возможность получения значений параметров, распределения, после чего на основе диаграммы Пирсона решается вопрос о статистической модели. Диагностика типа распределения является фактором корректного использования критериев схожести различимости, при этом только при B=I и B=3 используется статистика Стьюдента. Во всех остальных случаях вопрос о критерии различимости решается в зависимости от величины выборки и строгости требуемых доказательств в режиме принятия решений: критерий Вилкоксона, Смирнова-Колмогорова, Крамера-фон-Мизеса. К статистической таблице присоединяется каталог с именами выборок, критерии схожести — различимости представлен в виде матрицы, в ячейках которой указывается наличие и вероятность различия между выборками. Особенность использования критерия Вилкоксона в исследованиях клеточных совокупностей эпителиоцитов слизистой является его преобразование в форму, достаточную для получения значения самого критерия, его верхней и нижней границы в зависимости от степени достоверности различий.
Топохимическое исследование предполагает обязательным регистрацию содержания метаболитов, активности дегидрогеназ на протяжении от базальной мембраны до поверхностных эпителиоцитов. При этом исследование проводится в двух вариантах: с использованием сканирующего привода и самописца с малой постоянной времени, счета величин экстинций на протяжении строба при микротелевизионных исследованиях. Технические средства позволяют получить из микродегистограммы информацию о распределении плотностей вероятности функций на протяжении линии сканирования, а также после нормирования сканограммы по «X» и «Y» кривой топохимического профиля. В исследованиях многослойного плоского эпителия полости рта получены значения градиентов содержания РНК, белка, нейтральных гликопротеинов свободного и связанного катионного белка, гистидина, аргинина, лизина, которые обеспечивают «барьерную функцию» эпителия десны [1, 2].
Идентификация активности ферментных систем способом счета величин активности вдоль линий сканирования (стробов) позволяет получить статистические данные о соотношении уровня дегидрогеназных систем. Обычно для этого используются значения активности ферментов — маркеров отдельных видов метаболизма, объединенных понятием «метаболический профиль». Ферменты лидеры группируются по внутриклеточной топографии и принадлежности к отдельным видам обмена.
Определяются величины активности митахондриальносвязанных дегидрогениаз, маркеров цикла Эмбдена-Меейергофа, гликолиза, пентозов-фосфатного пути превращения глюкозы, биосинтеза CoA и первичного бэта-окисления липидов, обмена этанола. Сгруппированные в таком виде показатели активности дегидрогеназ рассматриваются как комплексная тканеспецифическая оценка слизистой полости рта. Ее изменения при воздействии различных патологических факторов, уровня трофического обеспечения, механической нагрузки, значения pH слюны рассматриваются как эквиваленты компенсаторного и адаптивного процесса, его состоятельности.
Конечным этапом вероятно-статистического анализа патологии слизистой оболочки полости рта является определение близколежащих признаков на основе алгоритма «Спектр». Соответствующая программа дает возможность определения групп близколежащих признаков и получить данные в виде таблицы и в форме диаграммы. Использование алгоритма «Спектр» в стоматологии привело к решению ряда задач оценки слизистой, которые укладываются в существующие представления о компьютерной классификации объектов медико-биологического исследования.
Использование вероятностно-статистических приемов в медицинской практике является перспективным направлением, когда появляется возможность достоверной интерпретации полученных результатов.
Литература:
- Лепехина Л. И. Роль некоторых биополимеров в реализации барьерной функции десны / Л. И. Лепехина, О. А. Лепёхина // Международный журнал экспериментального образования — 2016 — № 10 — С. 231.
- Лепехина Л. И. Тканеспецифические особенности диссоциации «тканевого барьера» многослойного плоского эпителия десны у пациентов с пародонтитом / Л. И. Лепехина, О. А. Лепёхина, Э. Г. Быков // Морфология. — 2009. — Т.136, № 4. — С. 88.
