Влияние липосомальной формы липоевой кислоты на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз

Показано, что «пустые» фосфатидилхолиновые липосомы и в значительной степени липосомы содержащие α-липоевую кислоту, препятствуют повышению гранулярности тромбоцитов, вызванной арахидоновой кислотой. Используя метод проточной цитофлюометрии обнаружено, что ФХ-липосомы и липосомальная форма α-липоевой кислоты, подавляют флуоресценцию активированных арахидоновой кислотой тромбоцитов, обусловленную окисленными флавопротеинами. Методом флуоресцентной микроскопии установлено, что флуоресцентно-меченные липосомы контактируют с тромбоцитами.

Введение.

Сосудистые заболевания головного мозга находятся на втором месте среди всех причин смерти, уступая заболеваниям сердечно-сосудистой системы и опережая онкологическую патологию. Не менее, важен фактор ишемии в развитии хронических нарушений мозгового кровообращения, вследствие чего образуется сосудистая деменция. Поэтому ишемический инсульт следует рассматривать в качестве ключевого патогенетического фактора развития самых разнообразных нозологических форм в рамках сосудистой патологии головного мозга и, в первую очередь, инсульта [1].

Гипоксия мозга приводит к повреждению механизмов ауторегуляции мозгового кровообращения. Основные патогенетические механизмы инсульта включают в себя [2]: снижение мозгового кровотока, возникновение и прогрессирование оксидантного стресса; микроциркуляторные нарушения, воспалительные реакции, повреждения ГЭБ и др.

Избыточная склонность к образованию тромба в кровеносных сосудах является одной из ведущих причин нарушений мозгового кровообращения. Такие нарушения, включающие в себя как острые ишемические инсульты, так и хроническую дисциркуляторную энцефалопатию, к сожалению, наблюдаются нередко и часто приводят к инвалидизации или даже смерти больного. Поскольку в основе избыточного тромбообразования нередко лежит чрезмерно высокая активность тромбоцитов, при профилактике и лечении цереброваскулярных заболеваний необходимо применять антиагрегационные и антиоксидантные лекарственные средства, нормализующие повышенную склонность тромбоцитов к адгезии и агрегации.

Отечественные и зарубежные научные публикации по этой теме [3, 4] показывают, что одним из наиболее универсальных и перспективных антиоксидантов в комплексной терапии ишемии головного мозга в настоящее время является альфа-липоевая кислота (ЛК). Тиоловые соединения ЛК способны накапливаться в мозге и обладают выраженным защитным антиоксидантным действием при инсульте и гипоксии. В организме ЛК образует окислительно-восстановительную систему, которая участвует в переносе ацильных групп в составе многокомпонентных ферментных систем.

Однако основными недостатками ЛК являются её плохая растворимость в воде (в водных растворах), быстрое связывание с различными белками [5] и, как следствие, плохая биодоступность. Это заставляет принимать пациентов очень большие дозы препаратов ЛК в течение длительного времени (периода лечения). Как правило, практикуется внутривенное введение ЛК. Создание новых лекарственных форм данного препарата с целью улучшения биодоступности является актуальной проблемой в наши дни.

В связи с этим целью данной работы является исследование влияния липосомальной формы липоевой кислоты на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз человека.

Для выполнения поставленной цели были сформулированные следующие задачи:

1) Оценить взаимодействие флуоресцентно-меченных фосфатидилхолиноых липосом с тромбоцитами;

2) Изучить влияние липосомальной формы ЛК на показатель изменения внутриклеточных макроструктур тромбоцитов (гранулярность);

3) Исследовать влияние липосомальной формы α-ЛК собственную флуоресценцию тромбоцитов, обусловленную окисленными флавопротеинами;

Материалы иметоды.

Реактивы иоборудование

В работе использовали фосфатидилхолин Lipoid S-100 94 % чистоты, выделенный из бобов сои («Lipoid GmbH», Германия), флуоресцентно-меченный фосфатидилхолин (1-Oleoyl-2- [12- [(7-nitro-2–1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]dodecanoyl]-sn-Glycero-3-Phosphocholine, Avanti Polar Lipids, США), α-липоевую кислоту (± α-Lipoic аcid, «Sigma–Aldrich», США). В качестве индуктора агрегации тромбоцитов использовали арахидоновую кислоту (Кат. № АГ-8) фирмы НПО «Ренам», Россия. рН среды в буферных растворах определяли при рН-метра-милливольтметра inoLab pH 7110 (WTW, Германия).

Для получения высушенной липидной пленки использовали ротационный испаритель Heidolph LABOROTA 4000 eco /WB /G5 (Германия). Флуоресцентно-меченные липосомы получали при помощи миниэкструдера «LiposoFast basic» (Avestin Inc., США), с использованием фильтров «Whatman» (США) с размером пор 100 нм.

Для взятия венозной крови использовали стандартные пробирки (V=4,5мл) с антикоагулянтом цитратом натрия 3,2 % Vacuette®, кат. № 454329 (Австрия) и стандартные пробирки (V=9мл). Плазму крови, обогащенную тромбоцитами, получали с использованием мульти центрифуги СМ-6МТ ELMI (Латвия).

Получение флуоресцентно-меченных липосом.

Исходное количество липидов ФХ и ФХ меч. (20 мг, соотношение 19:1) растворяли в хлороформе и упаривали растворитель на роторном испарителе. Липидную пленку диспергировали 1 мл фосфатным буферным раствором (рН = 7,4) и затем замораживали и оттаивали 5 раз. ОЛВ получали методом экструзии, используя поликарбонатный ядерный фильтр с диаметром пор 100 нм. Размеры полученных липосом определяли с помощь турбодиметрического метода и метода динамического светорассеивания.

Подготовка образцов крови.

Эксперименты проводили in vitro на образцах крови, взятых у здоровых доноров. У всех участников было получено добровольное согласие на взятие биоматериала. Обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) получали центрифугированием крови в течение 10 мин. при 135 g., при комнатной температуре. Отбирали надосадочную жидкость. Потом осадок центрифугировали в течение 20 мин. при 840 g для того, чтобы получить обедненную тромбоцитами плазму (БТП). В дальнейшем её использовали для вычета фона при обработке результатов.

Пробоподготовка флуоресцентно-меченных липосом к флуоресцентной микроскопии

Полученные образцы липосом ФХ-ФХмеч. (соотношение липидов 19: 1) разбавляли в натрий-фосфатном буферном растворе (pH = 7,4) в 20 раз (Слипид в пробе = 1 мг/мл) и просматривали в флуоресцентном микроскопе Zeiss Axio Observer Z1 (Германия) с использованием флуоресцентного фильтра FITC (Ex/Em = 495nm/530nm, увеличение 20-Х).

К образцам с обогащенной тромбоцитами плазмы (V = 95 мкл, 3,5*10⁵) добавляли липосомы ФХ-ФХмеч (V = 5 мкл, pH = 7,4) и инкубировали в течение 10 минут при Т = 37 ⁰С. Потом полученные образцы просматривали в флуоресцентном микроскопе Zeiss Axio Observer Z1 (Германия) использованием флуоресцентного фильтра FITC (Ex/Em = 495nm/530nm, увеличение 40-Х).

Метод исследования процесса дегрануляции тромбоцитах иметаболических процессов, протекающих вданных клетках.

В образцы с обогащенной тромбоцитами плазмой (ОТП, V= 225 мкл), добавляли «пустые» ФХ липосомы, или липосомы с ЛК, или водорастворимые формы липоевой кислоты (ЛК в физ. р-ре. или этилендиаминовую соль ЛК) в объеме 10 мкл, инкубировали в течение 5 минут при Т= 37 ⁰С. Затем добавляли индуктор агрегации Тц арахидоновую кислоту (V = 25 мкл, С = 1 мг/мл). Анализ образцов проводили на проточном цитофлюориметре Beckman Coulter CytoFLEX при воздействии на тромбоциты монохроматическим излучением при длине волны возбуждения 488 нм. Спектры бокового и фронтального светорассеяния регистрировали в течение 5 минут. Полученные результаты экспериментов обрабатывали в программе CytExpert.

Результаты иобсуждение.

В настоящей работе оценивалось влияние липосомальной формы липоевой кислоты на функциональную активность тромбоцитов.

Исследование взаимодействия фосфатидилхолиновых липосом стромбоцитами.

На первом этапе работы нас заинтересовал вопрос, как взаимодействуют липосомы с тромбоцитами. С целью изучения морфологии тромбоцитов и взаимодействия их с флуоресцентно-меченными фосфатидилхолиновыми липосомами использовали метод флуоресцентной микроскопии. Для исследования морфологии меченных наночастиц использовали липосомы с липидным составом ФХ-ФХмеч. (соотношение липидов 19:1, Рис.1).

1. Фосфатидилхолин (лецитин).

2. ФХ меченный (ФХмеч.) 1-Oleoyl-2- [12- [(7-nitro-2–1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]dodecanoyl]-sn-Glycero-3-Phosphocholine

Рис.1 Структурные формулы липидов (ФХ).

Полученные образцы флуоресцентно-меченных наночастиц разбавляли в натрий-фосфатном буферном растворе (pH = 7,4) в 20 раз и просматривали в флуоресцентном микроскопе Zeiss Axio Observer Z1. Полученные результаты исследований представлены на рис.2.

Данные флуоресцентной микроскопии свидетельствуют о том, что меченные липосомы имеют высокую интенсивность флуоресценции зеленого цвета (Em = 530nm), обусловленную наличием флуоресцентной метки на конце гидрофобной части ФХ. При хранении при Т= + 4 ⁰С флуоресцентно-меченных липосом в течение 3 месяцев происходило формирование небольших агрегатов наночастиц (Рис.2).

Обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) разбавляли в фосфатном буферном растворе. Затем к ОТП добавляли меченные липосомы и инкубировали в течение 10 минут при Т = 37 ⁰С. В дальнейшем полученные образцы просматривали в флуоресцентном микроскопе. Полученные результаты исследований представлены на рис.3.

В результате проведенного исследования было обнаружено, что флуоресцентно-меченные липосомы располагаются на поверхности тромбоцитов (Рис 3 А, В). На Рис.3 (В) видны агрегаты Тц с флуоресцентно-меченными (ФХ-ФХмеч.) липосомами, которые, по-видимому, встраиваются в мембрану тромбоцитов.

Исследование влияние липосомальной формы ЛК на светорассеяние исобственную флуоресценцию тромбоцитов.

На следующем этапе исследований мы изучали влияние липосомальной формы ЛК на функциональную активность тромбоцитов, используя метод проточной цитофлуорометрии. Данный метод позволяет подробно описать морфологические признаки тромбоцитов (Рис. 4).

На Рис. 4 представлена двумерная гистограмма отношения бокового и прямого светорассеяния плазмы крови обогащенной тромбоцитами (Рис. 4 а) и плазмой обедненной тромбоцитами (Рис. 4 б). Как мы видим на представленном (Рис. 4 а), регистрируются две фракции: тромбоциты и компоненты плазмы. Для сравнения и дальнейшей обработки результатов исследований приведена двумерная гистограмма отношения бокового и прямого светорассеяния в которой отсутствует тромбоцитарная фракция (Рис. 4 б) (компоненты обедненной тромбоцитами плазмы).

На Рис. 5 а и Рис. 5 б представлены обработанные данные по прямому и боковому светорассеянию тромбоцитов и плазменных компонентов (Рис. 5 а). Интенсивность светорассеяния тромбоцитарной фракции, значительно превосходит интенсивность светорассеяния плазменных компонентов, поэтому в дальнейшем при обработке полученных результатов экспериментов мы не учитывали вклад интенсивности (фона) от обедненной плазмы тромбоцитов.

Влияние препаратов с ЛК на изменение гранулярности тромбоцитов, обусловленную арахидоновой кислотой, исследовали с помощью метода проточной цитометрии. В образцы с обогащенной тромбоцитами плазмы добавляли или «пустые» ФХ липосомы, или липосомы с ЛК, или водорастворимые препараты с липоевой кислотой, потом инкубировали в течение 5 мин. (Т= 37 ⁰С). Затем добавляли индуктор агрегации Тц арахидоновую кислоту.Анализ образцов проводили на проточном цитофлюриметре. Спектры бокового и фронтального светорассеяния регистрировали в течение 5 минут. Результаты данного эксперимента представлены на Рис 6 и 7

На Рис. 6, представлена зависимость количества событий от интенсивности бокового светорассеяния тромбоцитов из проведенных исследований на одном доноре. Более подробно результаты исследования представлены на (Рис. 7) при обработке результатов исследований проведенных на 10 донорах.

На следующем этапе работы проводили исследования влияния липосомальных препаратов на метаболические и энергетические процессы, протекающие в тромбоцитах, при активации их арахидоновой кислотой. Из литературных данных известно, что при воздействии на клетки монохроматическим излучением с длиной волны 488 нм регистрируется собственное свечение клеток [9]. Данный процесс обусловлен свечением окисленных флавопротеинов [10]. Окисленные флавопротеины входят в состав оксидоредуктаз, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях, происходящих в клетках, а также входят в состав ксантин-оксидазы, альдегидоксидазы, дигидрооротатдегидрогеназы, ацил-КоА-дегидрогеназы и транспортирующих электроны флавопротеинов, которые составляют до 80 % митохондриальных флавопротеинов. Таким образом, свечение окисленных флавопротеинов отражает не только метаболические процессы в клетке, но и работу ее энергетического аппарата [11, 12].

Из проведённых результатов экспериментов (Рис.8) было обнаружено, что нативные тромбоциты имеют собственное свечение, т. е. незначительное количество содержания окисленных флавопротеинов, при воздействии на них монохроматическим излучением с длиной волны 488 нм. Добавление арахидоновой кислоты приводило к значительному увеличению интенсивности свечения данных клеток и, следовательно, к увеличению протекания в них метаболических и энергетических процессов, связанных с образованием большего количество окисленных флавопротеинов и высокой ферментативной активностью (Рис.8.). При добавлении как «пустых» фосфатидилхолиновых липосом, так и липосом с ЛК, происходило снижение свечения тромбоцитов, обусловленное флуоресценцией окисленных флавопротеинов, причем данный эффект был значительно выражен при добавлении липосом, содержащих липоевую кислоту. Добавление водорастворимых форм ЛК (ЛК в физиологическом растворе и этилендиаминовая соль ЛК) в незначительной степени повлияло на изменение интенсивности сечения тромбоцитов, и на уровни процессов окисления в клетках окисленных флавопротеинов и ферментативной активности в клетках. Это указывает на то, что липосомы с ЛК, а также в незначительной степени водорастворимые формы ЛК оказывали влияние на метаболические и энергетические процессы внутри тромбоцитов. Наиболее значительный эффект на метаболические и энергетические процессы, протекающие внутри тромбоцитов оказывали липосомы, содержащие ЛК (Рис.8). Сами липосомы вносили незначительный вклад в регистрируемое свечение и имели низкие значения интенсивности флуоресценции, которыми при обработке результатов можно пренебречь (Рис. 8, вставка). Полученные результаты исследований можно объяснить следующим образом, липиды, входящие в состав липосом при взаимодействии с тромбоцитами, по-видимому, встраивались в мембрану клеток и понижали энергетический статус клеток за счет антиоксидантного действия (компенсация окисленных липидов в мембране тромбоцитов клеток). При взаимодействии тромбоцитов липосом с липоевой кислотой происходило встраивание липидов в мембрану клеток, и высвобождение липоевой кислоты внутрь цитоплазмы клеток, в которых под воздействием клеточных ферментов происходило восстановление липоевой кислоты до её восстановленной формы — дигиролипоевой кислоты. Дигидролипоевая кислота, в свою очередь оказывала антиоксидантное действие при протекании окислительных процессов в клетке, значительно снижала уровни окисленных флавопротеинов, тем самым, поддерживая окислительно-восстановительный статус. Водорастворимые формы липоевой кислоты (ЛК в физиологическом растворе и этилендиаминовая соль ЛК), по-видимому, в незначительных количествах проникали внутрь клеточной мембраны, при этом происходило небольшое уменьшение уровня окисленных флавопротеинов в тромбоцитах.

Заключение.

Таким образом, в ходе работы было показано, что «пустые» фосфатидилхолиновые липосомы и в значительной степени липосомы содержащие α-липоевую кислоту, препятствовали снижению гранулярности тромбоцитов, вызванной арахидоновой кислотой. Используя метод проточной цитофлюометрии было обнаружено, что ФХ-липосомы и липосомальная форма α-липоевой кислоты, а также в незначительной степени водорастворимая форма α-липоевой кислоты подавляли флуоресценцию активированных арахидоновой кислотой тромбоцитов, обусловленную окисленными флавопротеинами и, тем самым оказывали влияние на метаболические и энергетические процессы в клетках. Методом флуоресцентной микроскопии было установлено, что флуоресцентно-меченные липосомы располагаются на поверхности тромбоцитов.

Литература:

1. С. Г. Бурчинский. Ишемия головного мозга: возможности комплексной фармакологической коррекции. Статьи института геронтологии АМН Украины// Т. 14, 2006, 15–18.
2. Гусев Е. И., Скворцова В. И. Ишемия головного мозга. // М.: «Медицина», 2001., 328 с.
3. Соловьева Э. Ю., Миронова О. П., Баранова О. А. и др. Свободнорадикальные процессы и антиоксидантная терапия при ишемии головного мозга // Журн. неврол. психиат., 2008., Т. 108, № 6.
4. Mitsui Y., Sahmelzer J. D., Zollman P. J. et al. Alpha-lipoic acid provides neuroprotection from ischemic-reperfusion injury of peripheral nerve. // Journal of the Neurological Sciences 163, 1999, 11–16.
5. S. Akiba, S. Matsugo, L. Packer, and T. Konishi.Assay of Protein-Bound Lipoic Acid in Tissues by a New Enzymatic Method. // Analytical biochemistry T 2, 1998, Article №. AB982615, с. 299–304.
6. Суслина З. А., Сейфулла Р. Д., Ионова В. Г., Каплун А. П., Прохоров Д. И., Шилова А. Г. Влияние ацетилсалициловой кислоты в комплексе с липидными наноструктурами различного состава на агрегацию тромбоцитов человека.// Т. 74, № 5, 2011, с. 31–34.
7. В. А. Щелконогов, Сорокумова Г. М., О. А. Баранова А. В. Чеканов, К. Д. Казаринов и др. Липосомальная форма липоевой кислоты: получение и определение антиагрегационной и антиоксидантной активности.// Биомедицинская химия. 2016, 5, 577–583 с.
8. В. А. Щелконогов, Сорокумова Г. М., О. А. Баранова, А. В. Чеканов, К. Д. Казаринов и др. Антиагрегационная эффективность липосомальной формы липоевой кислоты. (тезисы доклада, англ.,русс.) Международная научно-практическая конференция «Биотехнологии в комплексном развитии регионов». 15–17 марта 2016, Москва.
9. Shimomura O. Discovery of green fluorescent protein (GFP)(Nobel Lecture).// Angew Chem Int Ed. 2009;48(31):5590–5602
10. Filip S., Danijel P., Naoyuki H., Yasushi M., Ana S. et. all. Monitoring mitochondrial electron fluxes using NAD(P)H-flavoprotein fluorometry reveals complex action of isoflurane on cardiomyocytes.// Biochimica et Biophysica Acta 1797 (2010) 1749–1758.
11. Filip S., Danijel P., Naoyuki H., Yasushi M., Ana S., Amadou K. C., Tetsuro W., Zeljko J. B., Martin B. Monitoring mitochondrial electron fluxes using NAD(P)H-flavoprotein fluorometry reveals complex action of isoflurane on cardiomyocytes.// Biochimica et Biophysica Acta 1797 (2010) 1749–1758
12. Lienhart, Wolf-Dieter; Gudipati, Venugopal Macheroux, Peter. «The human flavoproteome».// Archives of Biochemistry and Biophysics. 535 (2), 2013, 150–162, doi:10.1016/j.abb.2013.02.015