Изменение функциональной активности лимфоцитов человека под действием липополисахаридов Haemophilus influenzae

Исследования выполнены с целью изучения влияния липополисахаридов Haemophilus influenzae на функциональную активность лимфоцитов. Были использованы концентрации липополисахаридов 10, 50, 100 мкг / мл. При увеличении концентрации ЛПС повышалась продукция ИЛ-2 Т-лимфоцитами, увеличивалось количество Т- и В-лимфоцитов с маркером апоптоза CD95, уменьшался уровень Е-РОК и М-РОК. Данное влияние липополисахаридов было наиболее выраженным при воздействии на клетки их концентрации 100 мкг / мл.

Липополисахарид (ЛПС) грамнегативных бактерий выполняет две важнейшие функции: определяет антигенную специфичность и является главным фактором патогенности. ЛПС грамнегативных бактерий — это эндотоксины, которые вызывают иммунологические реакции, в том числе поликлональную активацию иммунной системы, имеют способность стимулировать или угнетать ответ на конкретные антигены, индуцировать поликлональную иммунологическую толерантность [2, С. 22; 3, С. 106; 5, С. 11–47]. Рецепторы к ЛПС присутствуют на плазматических мембранах макрофагов, моноцитов, нейтрофилов и эндотелиоцитов. ЛПС стимулируют гуморальный ответ и действуют иммуносупрессивно на клеточный иммунитет, влияют на функциональную активность лимфоцитов. Влияние ЛПС на Т-хелперы первого типа и на розеткообразующую способность Т- и В-лимфоцитов является дозозависимым [1, С. 20; 4, С. 24; 6, С. 13]. Тема работы является фрагментом научной темы кафедры патофизиологии ГУ «Луганский государственный медицинский университет» «Влияние экзогенных и эндогенных факторов окружающей среды на реактивность организма и способы коррекции возникающих изменений».

Цель работы: изучить in vitro дозозависимое влияние ЛПС Haemophilus influenzaе (H. influenzaе) на функциональный статус лимфоцитов периферической крови человека.

Материалы иметоды исследования. Объектом исследования были лимфоциты, которые были выделены из периферической крови 25 здоровых мужчин 18–34 лет. ЛПС были получены водно-феноловой экстракцией при 65 °С из клеточных стенок бактерий, изолированных от 20 больных 45–65 лет, страдающих пневмонией, вызванной H. influenzaе, которые находились на стационарном лечении в отделениях хирургического профиля в Луганской областной клинической больнице.

ЛПС H. influenzaе использовали в концентрации 10, 50, 100 мкг / мл, контакт с лимфоцитами продолжался в течение одного часа при температуре 37 ºС. Определяли продукцию клетками ИЛ-2, влияние разных концентраций ЛПС на розеткообразующую функцию Т- и В-лимфоцитов (Е-розеткообразующие клетки — Е-РОК и М-розеткообразующие клетки М-РОК) и их апоптоз. В качестве контроля были приняты показатели интактных лимфоцитов. Полученные цифровые результаты обрабатывали статистически, считая данные статистически значимыми при уровне значимости p ≤ 0,05.

Таблица 1

Показатели, полученные вкачестве референтной нормы

Результаты исследования. О секреторной функции лимфоцитов и о влиянии на нее ЛПС судили по изменению образования ИЛ-2 — лимфокина, который продуцирует Т-хелперы первого типа. Спонтанная продукция Т-хелперами первого типа ИЛ-2 составила 1,6 ± 0,15 пг / мл, что и было принято в качестве референтной нормы. При внесении в среду культивирования лимфоцитов ЛПС H. influenzaе продукция ИЛ-2 увеличивалась. Изменения секреторной активности лимфоцитов крови человека зависели от концентрации ЛПС. При использовании минимальной концентрации ЛПС H. influenzaе — 10 мкг / мл образование ИЛ-2 увеличивалось в 1,75 раза относительно референтной нормы, при увеличении концентрации ЛПС до 50 мкг / мл количество ИЛ-2 увеличивалось в 11,6 раза. Увеличение действующей дозы ЛПС H. influenzaе до 100 мкг / мл приводило к существенной активации секреторной функции лимфоцитов. Внесение в среду культивирования лимфоцитов ЛПС данного патогена в действующейконцентрации 100 мкг / мл вызывало наибольшее образование ИЛ-2, которое составило в среднем, 19,5 ± 1,2 пг / мл (увеличение против референтной нормы в 12,2 раза) (Табл. 2).

Влияние ЛПС H. influenzaе на секреторную активность лимфоцитов in vitro

Примечание. * — р<0,05 при сравнении с референтной нормой (среда 199).

Использование разных концентраций ЛПС H. influenzaе значительно влияло на розеткообразующую функцию лимфоцитов. Известно, что тест розеткообразования позволяет судить как о количественном содержании лимфоцитов в единице субстрата, так и о функциональной активности лимфоцитов. Розеткой принято считать комплекс лимфоцита с тремя и больше эритроцитами, причем изменение количества последних дает представление про функциональную (розеткообразующую) способность как Т- так и В-лимфоцитов.

Таблица 3

Влияние ЛПС H. influenzaе на розеткообразующую спрособность Т- иВ-лимфоцитов крови человека in vitro

Примечание. * — р<0,05 при сравнении с референтной нормой (среда 199).

Как следует из приведенных данных, при отсутствии в среде культивирования Т-лимфоцитов (Е-РОК) ЛПС грамнегативных бактерий количество розеток составила 55 ± 3,3 %. Для В-лимфоцитов (М-РОК) розеткообразование при тех же условиях составило 24 ± 0,8 %. Установлено дозозависимое влияние ЛПС H. influenzaена розеткообразующую функцию Т- и В-лимфоцитов. Небольшие дозы ЛПС, возможно, в связи с митогенными особенностями, повышали способность Т и В клеток образовывать комплексы с эритроцитами. При использовании ЛПС в концентрации 10 мкг / мл имело место увеличение Е-РОК и М-РОК в 1,2 раза в сравнении с референтной нормой. Повышение дозы ЛПС сопровождалось снижением уровня Е-РОК и М-РОК. При увеличении действующей концентрации ЛПС H. influenzaе до 50 мкг / мл регистрировалось угнетение розеткообразующей способности как Т-, так и В-лимфоцитов. Диапазон уменьшения количества Е-РОК при указанной концентрации ЛПС составил 0,9 раза, М-РОК — 0,7 раза в сравнении с референтной нормой. Наиболее существенное уменьшение количества розеткообразующих клеток наблюдалось при использовании ЛПС H. influenzaе в концентрации 100 мкг / мл. По данному условию эксперимента уровень Е-РОК был ниже нормативного показателя в 0,6 раза, а М-РОК — в 0,5 раза (Табл. 3).

ЛПС H. influenzaе имеют особенность повышать уровень апоптирующих Т- и В-лимфоцитов при увеличении действующей концентрации.

Таблица 4

Примечание. * — р<0,05 при сравнении с референтной нормой (среда 199).

Инкубация лимфоцитов при 10 мкг / мл ЛПС H. influenzaе сопровождалась увеличением количества CD95. Уровень Т-клеток с маркером CD95 был достоверно выше, чем для В-клеток (р < 0,05). При минимальной действующей концентрации ЛПС (10 мкг / мл) увеличение апоптирующих Т-лимфоцитов было в 1,5 раза. При увеличении дозы ЛПС до 50 мкг / мл количество Т-клеток с маркером апоптоза CD95 выросло в 1,8 раза против референтной нормы. Концентрация ЛПС 100 мкг / мл увеличивала количество CD95-клеток в 2,4 раза.

При добавлении к среде культивирования Т-хелперов, индукторов ЛПС H. influenzaе в дозе 10 мкг / мл уровень Т-хелперов увеличивался в 1,6 раза. При действии на Т-клетки ЛПСH. influenzaе в дозе 50 мкг / мл кратность увеличения Т-лимфоцитов с маркером CD95 составила 2,4 раза. Обработка Т-хелперов с маркером апоптоза CD95 ЛПС в концентрации 100 мкг / мл вызывала увеличение уровня данных клеток в 3,1 раза.

Под влиянием ЛПС H. influenzaе in vitro усиливался апоптоз В-лимфоцитов крови человека. Наибольший уровень В-клеток с маркером апоптоза CD95 имел место при действии больших концентраций ЛПС. Добавление к среде культивирования В-клеток ЛПС H. influenzaе в дозе 10 мкг / мл приводило к росту количества апоптирующих лимфоцитов в 1,8 раза против референтной нормы. При действии на В-лимфоциты ЛПС H. influenzaе при концентрации 50 и 100 мкг / мл кратность увеличения апоптирующих В-клеток была в 2,7 и 3,5 раз относительно референтной нормы (Табл. 4).

Выводы иперспективы дальнейших исследований. ЛПС H. influenzaе при взаимодействии с клетками на протяжении 1 часа при температуре 37 ºС, в разных концентрациях вызывали изменение функциональной активности лимфоцитов. Впервые установлено дозозависимое и видоспецифическое влияние ЛПС H. influenzaе на цитокинпродуцирующую способность лимфоцитов крови человека, розеткообразующую способность и апоптоз Т- и В-лимфоцитов. По мере увеличения действующей на лимфоциты концентрации ЛПС H. influenzaе происходит прогрессивное увеличение продукции ИЛ-2, усиление апоптоза Т- и В-лимфоцитов, угнетение розеткообразующей способности лимфоцитов.

Данные, полученные нами в результате исследования, будут использованы для дальнейшего изучения биологических особенностей H. influenzaе как возбудителя внутрибольничной инфекции, и изучения патогенеза и состояния имммунной системы при гнойно-воспалительных заболеваниях, вызванных H. influenzaе, с целью разработки путей для предупреждения инфицирования в стационаре.

Литература:

1. Апоптоз и формы пролиферации как альтернативне формы ответа Т-лимфоцитов на стимуляцию [Текст] / М. Ф. Никонова, М. М. Литвина, М. И. Варфоломеева [и др.] // Иммунология. — 1999. — № 2. — С. 20–23.
2. Борисова Е. В. Роль структурных частей бактериального липополисахарида в его прямой иммуносупрессивной активности [Текст] / Е. В. Борисова // Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунологии. — 1999. — № 2. — С.22–25.
3. Ботвиньева В. В. Роль субпопуляций Т-лимфоцитов и лимфокинов в иммунном ответе [Текст] / В. В. Ботвиньева // Педиатрия. — 1998. — 4. — С. 106–108.
4. Гайдаш І. С. Апоптозіндукуюча активність ліпополісахаридів збудників гнійно-запальних захворювань у хірургічних хворих [Текст] / І. С. Гайдаш, В. В. Флегонтова, Є. В. Суглобов // Вісник морської медицини. — 2000. — № 3. — С. 24–28.
5. Госпитальные инфекции на рубеже тысячелетия [Текст] / [И. С. Гайдаш, В. В. Флегонтова, Н. К. Казимирко и др.]. — Луганск: Элтон-2, 2000. — 65 с.
6. Добродеева Л. К. Содержание в периферической крови CD95 — лимфоцитов [Текст] / Л. К. Добродеева, К. Г. Добродеев, О. А. Миролюбова // Иммунология. — 1998. — № 6. — С. 13–14.