Разработка технологии получения нового экологически безопасного биофунгицида на основе бактерий Bacillus subtilis для защиты озимой пшеницы от экономически значимых болезней

Установлены оптимальные условия культивирования для штаммов-продуцентов биопрепаратов Bacillus subtilis BZR 336g и B. subtilis BZR 517: температура, рН, время культивирования, источники углеродного и азотного питания. Были получены оригинальные образцы оптимизированных питательных сред, которые обеспечивают получение жидкой культуры препаратов с оптимальным количеством колониеобразующих единиц в сочетании с высокой антифунгальной активностью в отношении Fusarium graminearum и Fusarium oxysporum.

Ключевые слова: бактерии, Bacillus subtilis, температура, рН, время культивирования, источники питания, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum.

Optimal conditions for cultivation of B. subtilis BZR 336g and B. subtilis BZR 517 strains have been found in the course of the study: temperature, рН, cultivation time, carbon and nitrogen nutrition sources. The studies yielded optimized original samples of nutrient media to provide liquid culture preparations with an optimal amount of colony forming units combined with a high antifungal activity against Fusarium graminearum and Fusarium oxysporum.

Keywords: bacteria, Bacillus subtilis, temperature, рН, cultivation time, nutrition sources, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum.

Безопасной альтернативой химическим пестицидам для защиты растений в сельскохозяйственном производстве служат биологические препараты, а направление по созданию биопрепаратов для защиты растений становится все более актуальным [1].

Известно, что качество получаемого биопрепарата на основе микроорганизмов зависит, в том числе, от сбалансированности состава питательной среды. Поэтому, все большее значение приобретает поиск новых компонентов питательных сред, их оптимального соотношения с базисным составом среды и соответствия свойствам культивируемого объекта [2]. Таким образом, вопрос оптимизации условий культивирования бактерий является актуальным. В связи с этим, цель настоящего исследования – подобрать оптимальные условия культивирования для штаммов бактерий B. subtilis BZR 336g и B. subtilis BZR 517 – основы опытных образцов новых биофунгицидов для защиты озимой пшеницы от болезней, разработанных в лаборатории создания микробиологических средств защиты растений и коллекции микроорганизмов ФГБНУ ВНИИБЗР [3].

Объектами исследования послужили штаммы-продуценты биопрепаратов B. subtilis 336g [4] и B. subtilis BZR 517 [5]. Определение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизмов проводили методом Коха [6], определение антифунгальной активности бактерий - методом встречных культур [7], определение условий и сроков культивирования бактерий - с помощью стандартных методов [6, 7]. В тестах на антифунгальную активность использовали культуры фитопатогенных грибов F. graminearum Schwabe и F. oxysporum var. orthoceras Schlecht из коллекции ФГБНУ ВНИИБЗР.

В результате проделанной работы установлен температурный оптимум для культивирования перспективных штаммов: B. subtilis BZR 336g 30,0˚С, B. subtilis BZR 517 – 35,0° С. Определен оптимальный рН для выращивания бактериальных культур: B. subtilis BZR 336g 6,0 и 8,0, B. subtilis BZR 517 – 10,0. Максимальный титр жидкой культуры (ЖК) опытных образцов на основе штаммов B. subtilis BZR 336g и B. subtilis BZR 517 отмечен на среде, где в качестве источника углерода была использована меласса, а в качестве источников азота пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты.

На основании полученных данных были подобраны первые образцы оригинальных оптимизированных питательных сред. Установлено, что титр ЖК на основе штамма B. subtilis 336g на оптимизированной среде оказался на три порядка выше, чем на среде Кинга В, и на два порядка выше, чем на картофельно-глюкозной среде и составил (8,7±0,66) х 10¹⁰ КОЕ/мл. Для штамма B. subtilis BZR 517 оптимизированная питательная среда также оказалась более предпочтительной по данному критерию: титр ЖК составил (7,2±0,42) х 10¹⁰ КОЕ/мл, тогда как на среде КБ и картофельно-глюкозной среде (3,7±0,14) х 10⁸ и (1,8±0,07) х 10⁸ КОЕ/мл соответственно.

Исследования антагонистической активности показали, что для штамма B. subtilis 336g максимальное антифунгальное действие в течение всего периода инкубации отмечено на оптимизированной питательной среде и составило от 78,2 до 90,0 %.  Степень ингибирования F. graminearum в варианте со штаммом B. subtilis 517 к десятым суткам увеличивалась на всех питательных средах, однако существенной разницы по антифунгальной активности между вариантами выявлено не было.

В ходе исследований кинетики роста штаммов при периодическом культивировании установлено, что оптимальным сроком культивирования для штамма B. subtilis 336g является 36-48 ч., для штамма B. subtilis 517– 24-36 ч. Именно в указанных диапазонах отмечен максимальный титр ЖК: (2,4±0,24) х 10⁹ КОЕ/мл у штамма B. subtilis 336g и (1,4±0,06) х 10⁹ КОЕ/мл у штамма B. subtilis 517.

При этом в процессе исследования антибиотической активности в зависимости от сроков культивирования установлено, что максимальная активность в отношении тестерного гриба F. oxysporum у штамма B. subtilis 336g отмечена при культивировании от 24 до 48 ч, для штамма B. subtilis 517 – от 16 до 36 ч.

Таким образом, нами установлены оптимальные условия культивирования исследуемых штаммов и получены первые образцы оригинальных оптимизированных питательных сред. На последующих этапах планируется усовершенствовать состав оптимизированных питательных сред и разработать технологию получения биофунгицидов комплексного действия. Новые биофунгициды могут быть использованы для защиты озимой пшеницы в технологиях органического земледелия и в системах интегрированной защиты, существенно снижая пестицидный пресс на агроценозы юга России.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ и администрации Краснодарского края № 13-08-96533 р_юг_а.

Литература:

1.      Штерншис М.В. Тенденция развития биотехнологии микробных средств защиты растений в России // Вестник Томского ГУ. Биология. 2012. №2 (18). С. 92-100.

2.      Царенко И.Ю., Рой А.А., Курдиш И.К. Оптимизация питательной среды для культивирования Bacillus subtilis ИМВ В-7023 // Мікробіологическiй журнал. Т. 73. № 2. 2011. С. 13-19.

3.      Asaturova A.M., Dubyaga V.M., Tomashevich N.S., Zharnikova M.D., Zhevnova N.A., Homyаk A.I. Development of environmentally friendly bacterial biopreparations for the protection of fall wheat from Fusarium pathogens and other diseases // 10th International conference on plant diseases. 2012.  P. 709-716.

4.      Положительное решение о выдаче патента РФ от 27.02.2015 г. по заявке на патент РФ № 2013151377 от 20.11.2013 Штамм бактерий Bacillus subtilis BZR 336g для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов. / Асатурова А.М., Дубяга В. М.; Заявл. 20.11.2013. 

5.      Положительное решение о выдаче патента РФ от 27.02.2015 г. по заявке на патент РФ № 2013151375 от 20.11.2013 Штамм бактерий Bacillus subtilis BZR 517 для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов. / Асатурова А.М., Дубяга В. М.; Заявл. 20.11.2013.

6.      Практикум по микробиологии: Учеб, пособие / Под ред. А.И. Нетрусова. М.: Академия, 2005.  608с.

7.      Мосичев М.С., Складнев А.А., Котов В.Б. Общая технология микробиологических производств. М.: Легкая и пищевая пром-ть, 1982. 264 с.