Актуальность диагностики кандидоза в современных условиях, когда высокой является частота иммунодефицитных состояний, определяется тем, что классическая клиническая картина (типичный сметанообразный налёт на слизистой и языке — «молочница», трещины и атрофия сосочков, «заеды» в углах рта и т. п.) может быть стёртой или отсутствовать вообще, как например, при кандида-ассоциированном пародонтите (3, 4).

При непосредственном микроскопическом изучении нативного материала или посеве его на питательные среды грибы рода Candida из ротовой полости и слюны выделяются довольно часто в концентрации до 10 ² клеток в 1 мл, однако, даже количественная оценка высевов свидетельствует лишь о вероятности развития кандидоза, поскольку известно, что увеличение популяции грибов рода Candida у отдельных индивидумов может не сопровождаться возникновением инвазивного кандидозного процесса. Цитоморфологический (микроскопический) метод также не смог стать универсальным в прижизненной диагностике потому, что основанный на поиске псевдомицелия — активной тканевой формы Candida , он имеет ограничения по чувствительности. Следует учитывать, что если исследуемый фрагмент биоматериала (соскоб со слизистых оболочек, биопсия) не содержит псевдомицелия, нет гарантии отсутствия кандидозной инвазии в соседних участках ткани. По самым оптимистическим данным, частота обнаружения в биоптате псевдомицелия составляет менее 10–15 % (4, 5).

Иммунологические критерии также не могут служить надёжной основой дифференциальной диагностики носительства и кандидоза. По данным исследований последних лет, наиболее эффективным критерием развития кандидоза при отсутствии явной клинической картины является сочетание данных высокой степени обсеменённости 10 ⁵ клеток в 1 мл и положительных результатов ИФА с полисахаридным антигеном Candida (1, 4),

Дрожжеподобные резиденты, колонизирующие слизистую оболочку организма человека могут быть долгое время стабильны по качеству и количеству, при этом они не опасны для людей без нарушения местных защитных барьеров слизистых оболочек, развития иммунодефицитов или нейтропении (2, 6). Чаще кандидоз вызывают дрожжеподобные грибы C. albicans, которые продуцируют протеазы, гидролазы и интегриноподобные молекулы адгезии к экстрацеллюлярным матриксным белкам, а также другие факторы, продукция которых может различаться в зависимости от вида и штамма, причём вирулентность штаммов сильно варьирует (1, 2, 8).

При нарушении иммунной защиты, в том числе, под действием персистирующей вирусной инфекции, происходит реализация патогенного потенциала Candida преимущественно в полостях, выстланных слизистыми оболочками. Когда в просвете полостей и трубчатых структур устанавливаются различные сочетания Candida с бактериями, вирусами и подобная интеграция не сопровождается инвазией гриба в слизистые оболочки, она оценивается как кандидоносительство (5, 6).

Поэтому многие исследователи стали говорить о косвенных признаках возможной инвазии, к которым относят часто встречающиеся почкующиеся формы дрожжеподобных клеток и ростковых трубок, свидетельствующие об активном состоянии грибов (5, 6). Однако, это предположение всегда требует дополнительного подтверждения. Вышеизложенное, с одной стороны, определило возврат к оценке дополнительных возможностей методов иммунодиагностики, а с другой — к разработке молекулярных методов, в частности, полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Целью работы являлась разработка принципов диагностики кандидоза на основе сопоставления данных культурального, молекулярно-биологического и иммуноферментного исследования от пациентов с кандидозом слизистой оболочки полости рта и пародонта.

Материалы и методы исследования. Всего было обследованоипролечено 60 больных разными формами кандидоза слизистой оболочки полости рта (СОПР) и пародонта, в том числе, 29 мужчин и 31 женщина в возрасте от 23 до 69 лет. Для подтверждения диагноза использовали клинические и лабораторные — микроскопический, культуральный, иммуноферментный и молекулярно-генетический методы.

Для культурального (микологического) и молекулярно-генетического методов исследования использовали мазок стандартным тампоном со слизистой оболочки в области видимых изменений СОПР или содержимое пародонтального кармана, которое забирали сорбирующими файлами № 30. Далее тампон или файл помещали в транспортную среду Эймса. Выделение изолированных колоний грибов проводили на селективной хромогенной среде M1682 фирмы Himedia (Индия), а затем, по числу полученных изолированных колоний, определяли количественную обсеменённость содержимого (экссудата) пародонтального кармана в КОЕ/мл (рис. 1).

Рис. 1.Количественная оценка роста колоний дрожжеподобных грибов на хромогенной среде с одновременной идентификацией вида Candida albicans

Молекулярно-генетическое исследование включало постановку полимеразной цепной реакции и обратной гибридизации ДНК с применением отечественных диагностических систем (НПФ «Ниар-Медик+», РФ) на отечественной аппаратуре для амплификации ДНК «Терцик».

Для оценки результатов твёрдо-фазного иммуно-ферментного анализа (ИФА) использовали спектрофотометр «Мультискан» (Швеция). ИФА в твёрдой фазе использовали для определения антител сыворотки крови (2 мл венозной крови пациентов) к грибам Candida albicans для последующего сопоставления данных культурального и молекулярно-генетического обнаружения грибов с уровнем антител к ним.

Результаты исследования обработаны статистически с вычислением средней величины M, ошибки средней величины m и вероятности различий р. Для обработки результатов ИФА вычисляли также среднее квадратичное отклонение. При обработке результатов использовали компьютерную программу Biostat для Microsoft.

Результаты исследования и их обсуждение.

Клинический диагноз кандидоза слизистой оболочки полости рта или пародонта ставили при наличии характерной триады признаков:

1. клинических признаков воспаления;

2. обнаружении микроскопически при окраске по Граму псевдомицелия грибов рода Candida ;

3. превышении показателя обсеменённости 1 х 10 ² КОЕ/мл (lg>2,0).

По степени обсеменённости получено следующее распределение пациентов с учётом критериев, первоначально предложенных Р. Н. Ребреевой (5), а затем доработанных и расширенных другими авторами (3,4).

У 28-и пациентов выявлены грибы рода Candida в значительном количестве — lg KOE составил 6,5 + 0,5 (10,0 % от общего числа больных хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения). При осмотре полости рта у 5 пациентов выявлен обильный «сметанообразный налёт» с эрозированной слизистой под ним, что трактовалось нами как острый гиперпластический кандидоз. У 23 пациентов установлено наличие выраженного белого налёта на слизистой оболочке дёсен и языка, а также нёбных дужек и щёк. Выявленная картина соответствовала хроническому гипертрофическому кандидозу слизистой оболочки полости рта.

У 22-х пациентов степень обсеменённости была ниже 6,0 и составляла в среднем 4,5 + 1,1. У 10-и пациентов обсеменённость составляла 2,0±0,8. Элементов псевдомицелия не выявлено. У основной части пациентов этой группы клинически выявляли слабо выраженный налёт, но определяли микротрещины слизистой языка и щёк на фоне изменения цвета слизистой оболочки и сглаженности сосочков языка, а также трещины в уголках рта. Данная клиническая картина соответствовала хроническому атрофическому кандидозу слизистой оболочки полости рта.

Кроме того, у 17 пациентов выявлены явные признаки пародонтита средней и тяжёлой степени, причём, только у 6-и они сочетались с признаками атрофического кандидоза СОПР. Однако во всех случаях в пародонтальном кармане выявляли грибы рода Candida в количестве 5,2 + 0,4.

Распределение пациентов в зависимости от степени обсеменённости представлено на рис. 2.

Рис. 2. Распределение пациентов по степени обсемененности пародонтального кармана грибами Candida

Анализ клинической картины кандидоза СОПР показал, что частота выявления кандида-ассоциированного пародонтита при отсутствии явных клинических проявлений кандидоза СОПР оказалась довольно значительной — у ¼ пациентов. Только хронический гипертрофический кандидоз встречался чаще — у 38,3 % пациентов.

Диагноз кандидоза у всех пациентов подтверждён микроскопическим методом (цитоморфологически). При микроскопическом исследовании (окраска по Граму) у обследованных пациентов обнаружен псевдомицелий гриба в материале пародонтального кармана, взятого при завершении процедуры кюретажа пародонтальных карманов (рис. 3). Лишь у единичных пациентов аналогичная картина отмечена нами при исследовании мазка-соскоба со слизистой (рис. 4).

Рис. 3. Элементы псевдомицелия дрожжеподобных грибов рода Candida в содержимом пародонтальных карманов при кандида-ассоциированном пародонтите

Рис. 4. Мицелиальные (вверху слева) и дрожжеподобные (справа) элементы гриба Candida в соскобе слизистой больного хроническим гипертрофическим кандидозом

По результатам комплексного клинико-лабораторного и иммуно-микробиологического исследования выявлены следующие формы кандидоза:

1. острый гиперпластический кандидоз — у 5 пациентов (8,3 %);

2. хронический гипертрофический кандидоз — у 23 пациентов (38,3 %);

3. хронический атрофический кандидоз — у 15 пациентов (25 %);

4. кандида-ассоциированный пародонтит — у 17 пациентов (28,3 %).

Видовой состав дрожжеподобных грибов, выделенных со СОПР и из пародонтального кармана пациентов представлен на рисунке 5.

При идентификации выделенных чистых культур грибов установлено, что у 48-и больных из 60-и выделялся вид Candida albicans (у 80 % больных), причём у 8-и пациентов в ассоциации с другими видами: C. Krusei — у 4-х, C. guilliermondii — у двух и C. glabrata — у двух.

Таким образом, вид C. albicans доминировал по частоте выделения у больных кандидозом СОПР и хроническим пародонтитом в стадии обострения (кандида — ассоциированным пародонтитом).

На втором месте оказался вид C. Krusei , который выявлен у 8-и пациентов (13,3 % больных), в том числе, у 4-х в ассоциации с C. albicans . К единичным находкам можно отнести виды C. tropicalis и C. brumptii , а также C. guilliermondii и C. glabrata , выявленные только в ассоциациях с C.albicans .

Тем не менее, как свидетельствуют представленные данные, видовой пейзаж дрожжеподобных грибов рода Candida в содержимом пародонтального кармана у больных хроническим пародонтитом в стадии обострения отличается значительным разнообразием и включает, как минимум 6 видов грибов данного рода. На долю вида C.albicans приходится 70,6 %, C.Krusei — 11,8 %, прочих видов — 17,6 % всех выделенных штаммов.

Рис. 5. Видовой состав штаммов Candida, выделенных у пациентов с кандидозом СОПР и пародонта

Выявление дрожжеподобных грибов Candida albicans при заболеваниях пародонта в нашей работе впервые проводили не только культуральным, но и молекулярно-генетическим методом, используя отечественную систему Gene Pak ^TM PCR для выделения образцов ДНК из материала и постановки полимеразной цепной реакции (рис. 6).

У 17 больных хроническим пародонтитом в стадии обострения, которым проводили молекулярно-генетическое исследование с помощью ПЦР подтверждено наличие ДНК дрожжеподобных грибов Candida albicans в содержимом пародонтального кармана в диагностической концентрации.

Рис. 6. Соотношение положительных и отрицательных результатов обнаружения грибов разными методами (ПЦР)

Таким образом, общая цифра обнаружения грибов оказалась несколько выше, чем при культуральном исследовании. Дрожжеподобные грибы рода Candida выявлены нами непосредственно в содержимом пародонтального кармана, а у значительной части больных (10,9 %) в виде псевдомицелия, прорастающего десневой эпителий у больных хроническим пародонтитом в стадии обострения.

Из 60 больных хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения, которым проводили ИФА, наличие АТ к дрожжеподобным грибам Candida albicans в диагностической концентрации (более 1:200) выявлено у 35, что составило 58,3 % от общего числа пациентов, обследованных данным методом.

Таким образом, общая цифра обнаружения АТ сыворотки крови к грибам оказалась существенно выше (более, чем в 2 раза), чем обнаружение грибов при культуральном исследовании (рис. 7).

Рис. 6. Совпадение положительных результатов, полученных разными методами (ИФА) с учётом обсеменённости

Совпадение положительных результатов, детектируемых обоими методами, наблюдалось лишь в 82,0 % случаев. При этом, у 37 пациентов с положительными результатами культурального исследования, ИФА была положительной в 27 случаях (69,9 %), т. е. совпадение положительных результатов обоих методов было меньшим, чем при сопоставлении с ПЦР (совпадение положительных результатов культурального исследования и ПЦР наблюдалось в 82,0 % случаев). Напротив, у 35 пациентов дрожжеподобные грибы рода Candida не выявляли при культивировании на среде Сабуро и хромогенной среде, а ИФА была среди них была отрицательной только у 24 пациентов (53,3 %). В тоже время ПЦР в аналогичной ситуации была отрицательной лишь у 5-и пациентов ПЦР (6,9 %).

Выявленные расхождения, на первый взгляд, резко снижают диагностическую значимость ИФА при диагностике кандидоза, поэтому требуют соответствующей интерпретации с учётом чувствительности используемой тест-системы для ИФА, с одной стороны, и возможными ошибками при регистрации результатов культурального исследования, с другой. Поэтому, мы провели сопоставление результатов ИФА и культурального исследования с учётом количественной обсеменённости материала пародонтального кармана грибами. Как было показано при цитоморфологическом исследовании, прорастание псевдомицелия грибов в ткани пародонта наблюдается лишь при высокой и средней степени обсеменённости экссудата пародонтального кармана или, иначе, — обильное содержание грибов в пародонтальном кармане сопровождается их инвазией в ткани пародонта.

Из данных, представленных на диаграммах, очевидно, что при высокой и умеренной обсеменённости пародонтального кармана грибами ИФА всегда положительна и процент совпадения результатов составляет 100 %. При низкой обсеменённости АТ, напротив, не выявлены ни в одном случае.

Сопоставляя полученные нами результаты с известными данными литературы (1–7) можно представить следующим образом основные этапы патогенеза кандидозной инфекции пародонта.

При нормальном иммунном статусе имеет место синергизм микрофлоры десневой борозды, а также ротовой полости, выстланной слизистой оболочкой, с участием Candida , что можно расценивать как транзиторное кандидоносительство. В условиях не резко выраженных проявлений иммунодефицита, снижения иммунорегуляторного индекса CD4/CD8 и респираторной активности гранулоцитов, может развиться, так называемый, «просветочный прединвазивный кандидоз» (по О. К. Хмельницкому), в том числе, в зоне десневой борозды. При более выраженном нарушении параметров: снижении экспрессии CD16 (Fc-рецепторы для Ig) и CD25 (для цитокинов IL-2) на моноцитах, CD 4 (Т-хелперы/индукторы) и CD 16 на лимфоцитах неизбежно прогрессирование процесса с развитием инвазивного кандидоза как слизистой оболочки, так и тканей пародонта (2,5).

Поломка в системе многоуровнего антифунгального барьера, количественные и качественные нарушения со стороны нейтрофилов в просветах и на поверхности слизистых оболочек, а также изменения в Т-клеточной системе и экспрессии маркеров клеточной кооперации обусловливают возможность агрессии в виде адгезии, колонизации и инвазии резидентных условно-патогенных грибов.

При прижизненной дифференциальной диагностике кандидоносительства, просветочного прединвазивного и инвазивного кандидоза, основанной на комплексном подходе, должна быть предусмотрена возможность своевременного выявления отличающихся друг от друга форм взаимодействия Candida и макроорганизма, что определяет их более адекватное этиологическое и патогенетическое лечение.

Выводы

1. В современной структуре кандидоза СОПР (по обращаемости к стоматологу) ведущее место занимают хронические формы (гипертрофический кандидоз — у 38,3 %; атрофический кандидоз — у 25 %). В 28 % случаев мы диагносцировали атипичное течение кандидозного процесса полости рта, охарактеризованное нами как кандида-ассоциированный пародонтит.

2. Для точной этиологической диагностики кандидоза СОПР и пародонта необходимо сочетание культурального, микроскопического, молекулярно-биологического методов диагностики и иммуно-ферментного анализа, как скриннингового метода. Данные комплексного клинико-лабораторного обследования пациентов позволяют разделить всех пациентов на несколько групп в зависимости от отсутствия или наличия грибов в исследуемом материале и степени обсеменённости в диапазоне от 10 ² КОЕ/мл и выше.

Литература:

1. Быков А. С., Миронов А. Е. Частная микология / в кн. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология // под ред. академика РАМН В. В. Зверева и проф. М. Н. Бойченко. — М.: ГЭОТАР-Медиа. — 2010. — Т.2. — С. 380–423.
2. Кашкин П. Н., Хохряков М. К., Кашкин А. П. Определитель патогенных, токсигенных и вредных для человека грибов. — Л.: Медицина. — 1979. — 272с.
3. Комлева А. С., Миронов А. Ю., Недосеко В. Б., Чеснокова М. Г. Оптимизация консервативного лечения больных хроническим генерализованным пародонтитом, ассоциированным с дрожжеподобными грибами. / Стоматолог. — 2011. - № 1. — С.14–22.
4. Носик А. С. Разработка методов лабораторной диагностики и лечения кандида-ассоциированного пародонтита. Автореф…дисс. к.м.н. — М. — 2004. -25с.
5. Реброва Р. Н. Грибы рода Сandida при заболеваниях негрибковой этиологии. — М.: Медицина. -1989. — 128с.
6. Царёв В. Н. Обоснование антибактериальной терапии болезней пародонта //в кн. Терапевтическая стоматология //под ред. Г. М. Барера. — М.:ГЭОТАР-Медиа. — 2008. — Т.2. — с.189–200.
7. Cannon R. D., Firth N. F. Грибы и грибковые инфекции полости рта // в кн. Микробиология и иммунология для стоматологов //под ред. Дж. Ламонт, А. Берне, С. Лантц, Д. Лебланк. — М.: Практическая медицина. — 2010. — С. 378–392.
8. Kurnatowska A. J. Activity of hydrolytic enzymes of Candida albicans strains isolated from patients with periodontal and membrane mucosae of oral cavity diseases / Mycopathologia — 1998. — V.141. — N2. P.105–109