Морфологические методы и экспертный подход при верификации атрофии слизистой оболочки желудка в биопсийной диагностике атрофического гастрита

Атрофия слизистой оболочки желудка при хроническом гастрите по современным представлениям рассматривается как стартовая площадка для развития неоплазии/дисплазии и рака желудка кишечного типа [6, 9]. Соответственно интегральная морфологическая оценка степени выраженности атрофии в слизистой оболочке желудка (стадия хронического гастрита) атрофических процессов рассматривается в качестве ведущего прогностического фактора развития рака [9, 13-15]. В повседневной практике врача-патологоанатома распознавание атрофии вызывает определенные сложности, связанные с разнообразием классификационных подходов, неоднозначной интерпретацией морфологических признаков, с ограничениями технического характера [1-3]. Группа европейских и американских патологов и гастроэнтерологов, объединившихся в ассоциации Atrophy Club и OLGA (Operative Link on Gastritis Assessment), предложила в качестве персонифицированного риска канцерогенеза оценивать интегральный показатель атрофических изменений слизистой оболочки желудка, обозначив этот показатель стадией хронического гастрита. Стадия атрофического гастрита (0-IV) стала ключевой характеристикой новой его классификации – OLGA system [14-15]. В 2009 году была предложена визуально-аналоговая шкала градации атрофии, совмещенная с таблицей для определения стадии хронического гастрита – Российский пересмотр OLGA system [2-4].

Очевидна необходимость оценки возможности применения и разработки методов внедрения Международной классификации OLGA-system с использованием визуально-аналоговой шкалы (Российского пересмотр) на уровне практикующего врача-патологоанатома с целью обеспечения патоморфологического мониторинга и, в конечном итоге, профилактики рака желудка кишечного типа.

Целью настоящего исследования являлась оценка возможностей и ограничений методов верификации атрофии слизистой оболочки желудка для улучшения качества биопсийной диагностики хронического атрофического гастрита.

Материалы и методы исследования. Оценка пригодности текущего биопсийного материала в рутинной практике анализа материалов гастробиопсии для внедрения в диагностику принципов Российского пересмотра Международной классификации OLGA-system проведена путем анализа материала из архивов патологоанатомических отделений нескольких медицинских организаций города Омска, специализирующихся в области гастроэнтерологии, за период 2009-2011 год. Рассчитанный минимальный объем представительной необходимой выборки составил 9312 клинических случаев (серий микропрепаратов), представленных 21156 гастробиоптатами.

Для анализа воспроизводимости современной классификации хронического гастрита (стадии, как выраженности атрофии) использован метод оценки согласия экспертов (каппа Коэна), который на сегодняшний день является основополагающим методом для оценки совпадений заключений [10]. При проведении расчетов оценивали результаты парного сравнения показателей («каждый с каждым»). Рассчитывали медиану от всех значений каппы для каждого исследователя – индивидуальный показатель согласия, и медиану от полученных индивидуальных показателей – генеральная взвешенная каппа. Разработанный дизайн исследования предусматривал четырехэтапный просмотр материала с оценкой уровня согласия между экспертами. Взвешенная каппа рассчитана для номинальных параметров (градация и стадия атрофии), невзвешенная – бинарных (есть атрофия/нет атрофии). Оценку каппа-коэффициента проводили согласно рекомендуемым критериям [10]: менее 0,2 – плохое согласие, плохая степень согласованности; от 0,21 до 0,4 – удовлетворительное согласие (сносное), удовлетворительная степень согласованности; от 0,41 до 0,6 – умеренное согласие (среднее), умеренная степень согласованности; от 0,61 до 0,8 – хорошее согласие, хорошая степень согласованности; более 0,81 – очень хорошее (превосходное) согласие, очень хорошая степень согласованности.

В состав созданной группы экспертов входили 24 врача-патологоанатома: 12 «молодых» патологов с опытом работы 1-3 года и 12 стажированных патологов с опытом работы более 5 лет, для которых диагностика хронического гастрита является одним из компонентов рутинной морфологической диагностики. Все эксперты были патологоанатомами «общего профиля», то есть среди них не было лиц, специализирующихся исключительно в патологии желудка.

Группы экспертов работали в очной форме в различных режимах: первый этап без предварительного обучения, спустя 1-2 недели - второй этап - после устного индивидуального обучения, третий этап спустя 2-3 недели после обучения с целью оценки воспроизводимости и повторяемости результатов («выживаемость знаний»). После третьего этапа проводили обучение врачей-патологоанатомов по идентификации морфологических маркеров атрофии с помощью разработанного многоуровневого учебно-методического комплекса с использованием созданной компьютерной базы данных (рис. 1).

На всех этапах экспертам были предложены микропрепараты с проведением оценки интегрального показателя – стадии хронического гастрита. Материалом для данной исследовательской точки послужила референтная коллекция клинических случаев, представляющая собой 14 серий микропрепаратов, отобранных патологами-экспертами в рамках работы III съезда Российского общества патологоанатомов, – по 4-5 рекомендуемых современными классификациями биоптатов от каждого пациента из антрального отдела и тела желудка с окраской гистологических срезов гематоксилином и эозином, в отдельных случаях предлагались препараты с ШИК-реакцией в сочетании с альциановым синим при рН = 2,5 с целью простоты визуализации метапластических изменений.

Рис 1. Структура и содержание многоуровневого учебно-методического комплекса

Оценка валидности признаков атрофии слизистой оболочки желудка проведена путем расчета чувствительности, специфичности с связанных с ними показателей (прогностическая ценность положительного и отрицательного результата теста, отношения правдоподобия для положительного и отрицательного результатов). При наборе материала в данной исследовательской точке критериями исключения являлись наличие неопределенной атрофии, очаговой гиперплазии, полипов, интраэпителиальной неоплазии/дисплазии, аденомы с явлениями интраэпителиальной неоплазии/дисплазии, рака, эрозивно-язвенного дефекта. Для оценки практической пригодности использования выбранных нами гистохимических и иммуногистохимических маркеров атрофии слизистой оболочки желудка (речь идет, разумеется, о косвенных маркерах), нами были использовали принципы текущей критериальной валидности, которая характеризует способность маркерного признака измерять некоторые качества объекта и коррелировать с некоторым референтным внешним критерием, которым для нас является гистологическая характеристика атрофии. В связи с этим, в качестве такого референтного внешнего критерия мы составили коллекцию биоптатов &#; 250 гистологических препаратов).

При оценке наличия атрофии слизистой оболочки желудка по бинарной схеме: «есть атрофия &#; нет атрофии» критерий согласия (каппа Коэна) экспертов равнялся 1,0. Достигалось это достаточно искусственно заданными условиями отбора: выбраковывался любой гистологический препарат, по поводу которого хотя бы у одного эксперта было сомнение о наличии в нем атрофии слизистой оболочки желудка. Затем из оставшихся 118 образцов (гистологический препарат &#; парафиновый блок) методом рандомизации были выбраны 50 блоков. Из этих блоков приготовили серийные срезы, в которых и была проведена детекция маркерных признаков. Аналогичным методом были отобраны 50 образцов слизистой оболочки желудка, залитых в парафин, в которых отсутствовала атрофия слизистой оболочки.

Все микропрепараты имели одинаковый спектр гистологических, гистохимических и иммуногистохимических методов исследования, выбранных нами для простоты визуализации признаков метапластической атрофии.

Полученные при биопсии фрагменты слизистой оболочки (2 – из тела, 2 - из антрального отдела желудка, 1 – из угла желудка) фиксировали в 10%-ном нейтральном забуференном формалине (рН 7,2 – 7,4) в течение 12 - 24 часов, заливали в парафин по общепринятой методике. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Для определения профиля муцинов и типирования очагов кишечной метаплазии в клетках слизистой оболочки желудка использовались реакции с 1%-ным альциановым синим при рН=2,5 (кислые сиаломуцины), ШИК реакция на основе стандартной методики с основным фуксином, а также комбинация методов: альциановый синий (рН=2,5) + ШИК. Детекцию сульфомуцинов с помощью диамина железа дополняли окраской альциановым синим при рН=2,5.

Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах. Демаскировку антигена проводили в цитратном буфере (рН=6,0) при кипячении на водяной бане в течение 1 часа.

В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела (табл. 1). Биотилинированные антитела второго слоя и стрептавидин, меченный пероксидазой входили в систему визуализации KP-500 (“Diagnostic Biosystems”, США). В качестве хромогена использовался 3,3-диаминобензидина тетрахлорид, входящий в коммерческий указанный выше набор детекции. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера в течении 30 секунд – 2 минут.

Таблица 1

Панель антител, использованных в работе

Примечания: ¹ - “Novocastra”, Великобритания, ² – “Cell Mark”, США, ³ – “Spring», США, ⁴ - “DAKO”, Дания.

Оценку валидности гистохимического/иммуногистохимического маркера проводили по принципу детекции его отсутствия или наличия в исследуемом материале (есть маркер/нет маркера). Для оценки фактора желудочной дифференцировки Shh рассчитывали показатель интенсивности окрашивания цитоплазмы: 1– слабая, 2 – умеренная, 3 – выраженная, а также вычисляли процент позитивно окрашенных клеток от общего числа эпителиоцитов (≥1000 клеток) с подразделением на 5 градаций (0 – до 5%, 1 – 5-25%, 2 – 26-50%, 3 – 51-75%, 4 – 75% и более) позитивно меченых клеток. Оценку индекса экспрессии Shh вычисляли путем умножения показателя интенсивности окрашивания (1-3) на полуколичественно оцененную градацию (0-4).

Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли на микроскопе Axioskop 40 c использованием камеры AxioCam MRc5 и программного обеспечения AxioVision Rel. 4.7.2 (Carl Zeiss, Германия).

Расчет критерия согласия и параметров валидности методов детекции атрофии выполнен с использованием программы MedСalc 10.4.0.0.

Результаты и их обсуждение. Для оценки возможности верификации атрофии слизистой оболочки в рутинной работе врачей-патологоанатомов нами был произведен пересмотр 9312 диагностированных случаев (21 156 биоптатов) хронического гастрита из архивов патологоанатомических отделений нескольких медицинских организаций, специализирующихся в области гастроэнтерологии. Из всей выборки только 4,03% (375 случаев) соответствовали требованиям репрезентативности Международной классификации OLGA-system (5 фрагментов из точек приблизительно соответствующих Бэйлорскому протоколу).

После оценки морфологических изменений слизистой оболочки желудка материал был распределен на группы: количество биоптатов в одном случае составило 1 фрагмент слизистой оболочки – 1426 (1426 пациентов), 2 фрагмента слизистой оболочки – 10122 биоптатов (5061 пациент), 3 фрагмента – 2481 биоптатов (827 пациентов), 4 фрагмента – 3952 биоптатов (988 пациентов), 5 фрагментов – 3175 биоптатов (635 пациентов).

Диагноз атрофического гастрита был обозначен в 1150 наблюдениях (3156 биоптатов), но мог соответствовать при этом стандарту, заданному OLGA-system только в 36 случаев, представленных 162 биоптатами (3,1%). Разумеется, речь не идет об эпидемиологическом исследовании распространенности атрофического гастрита в популяции, поскольку все 9312 пациентов обратились в медицинскую организацию с какой-либо целью. То есть выборку мы составляли по обращаемости, а не методами, принятыми в эпидемиологии. И заключить можем лишь, что диагноз атрофического гастрита по стандарту, заданному OLGA-system, мог быть установлен только в 36 случаях (0,39% от общей выборки). Но это не значит, что остальные 99,61% выборки составляют пациента без атрофических изменений слизистой оболочки желудка. И дело даже не в том: отмечена атрофия слизистой оболочки в каком-то фрагменте или нет, а в том, что в 100% - 4,03% = 95,97% пациенты не получили персонифицированного прогноза.

Полученные столь низкие показатели прогноза при пересмотре гастробиоптатов объясняются количественными и качественными погрешностями эндоскопического забора материала, а также погрешностями обработки биоптатов в патологоанатомическом отделении. Проанализированы и классифицированы причины несоответствия стандартам OLGA-system. Анализ нарушений протокола эндоскопического забора материала по OLGA-system и технологии гистологической обработки биоптатов представлен в таблице 2.

Причины несоответствия исследованного материала стандартам OLGA-system можно разделит на две группы. Первая группа &#; нарушение протокола врачом эндоскопической диагностики. Вторая группа &#; несоответствие гистологических препаратов стандартам OLGA-system в результате нарушения технологии обработки биопсийного материала.

Таблица 2

Анализ нарушений протокола эндоскопического забора материала и технологии гистологической обработки биоптатов

Дефекты протокола забора биопсийного материала. В силу разных обстоятельств (недостаток времени, неадекватное поведение пациента, неумелые действия среднего медицинского персонала, отсутствие достаточного количества форцептов) врач эндоскопической диагностики производит биопсию не в тех участках, которые указаны в протоколе OLGA-system (Бэйлорский протокол), либо уменьшает количество биоптатов, либо вообще производит забор произвольно из зон, которые кажутся ему «подозрительными». Эти данные получены не путем анкетирования, но при личной беседе с врачами эндоскопической диагностики, материал которых пересматривался уже как объект патологоанатомического исследования.

К артефактам, возникшим при заборе материала (в эндоскопическом кабинете) следует отнести высыханием материала, когда фиксация не следует немедленно, неправильное извлечение фрагмента слизистой оболочки из биопсийных щипцов: наиболее эффективно это производить неостро отточенной спичкой или тупым стоматологическим зондом и ни в коем случае не стряхивать фрагмент слизистой оболочки с форцепта во флакон с фиксирующей жидкостью (в этом случае возможно прилипание кусочка к стенке флакона над фиксатором, и такой материал испорчен безвозвратно).

Обычно в протоколах эндоскопического исследования указывается зона, откуда взят биоптат, однако, нет практики отметки этих данных на флаконе с фиксирующей жидкостью, куда помещен фрагмент слизистой оболочки. Кроме того, зачастую несколько фрагментов помещают в один флакон тоже без всякой маркировки. Таким образом, патологоанатом лишен возможности надежно интерпретировать участок, из которого взят материал. Например, это антральный отдел или фрагмент из тела желудка с выраженной пилорической метаплазией. В тех случаях, когда патологоанатом диагностирует дисплазию/неоплазию эпителия, подобное заключение патологоанатома имеет очень малый смысл с позиций динамичного наблюдения с целью возможной мукозальной резекции, поскольку не указан точно участок, откуда получен материал.

Недостаточное снабжение биопсийным инструментом приводит к использованию биопсийных щипцов с тупыми браншами, что обусловливает эффект «скольжения» и получение недостаточного по объему материала &#; как правило, отсутствует мышечная пластинка. Дискуссионным является вопрос применения форцептов с наличием фиксирующей иглы. С одной стороны, надежное положение (фиксация) щипцов в момент забора материала создает возможность взятия кусочка с четким визуальным контролем (соблюдение протокола). Вместе с тем, наличие иглы увеличивает артефициальную деформацию материала.

Несоответствия гистологических препаратов стандартам OLGA-system в результате нарушения технологии обработки биопсийного материала. Артефициальная фрагментация кусочка слизистой оболочки возникает в результате использования нестандартных расходных материалов при проводке и заливке материала: марлевые мешочки вместо гистологических (биопсийных) кассет, перенос кусочков в парафин обычным пинцетом вместо ланцетовидной иглы или лопатки (наш опыт свидетельствует, что кусочек слизистой оболочки категорически нельзя сжимать любым инструментом, только перемещать).

Неправильная ориентировка кусочка при заливке в парафин, не позволяющая сделать срезы строго перпендикулярные поверхности слизистой оболочки, чтобы структура ямок, антральных желез и желез тела была представлена продольно ориентированными трубочками, а не поперечными или тангенциальными срезами тубулярных структур.

В фиксаторе фрагмент слизистой оболочки приобретает ладьевидную форму, следовательно, при заливке материала «ладья» должна быть ориентирована боком по отношению к плоскости резки материала/дну заливочной формы. Идеальной ориентировки можно добиться лишь применяя специальный адгезивный материал, к которому после извлечения из браншей биопсийных щипцов биоптат (например, система Endokit, Bio-Optica, Италия), однако, использование такого подхода вряд ли найдет широкое распространение в широкой практике в силу громоздкости самой процедуры, а также отсутствия мануальных навыков у медицинских сестер эндоскопических кабинетов для ее выполнения. Вполне понятно, что их мануальные навыки, ментальность, определяющая отношение к биопсийному материалу принципиально отличаются от таковых у медицинских лабораторных техников.

Остальные причины, перечисленные в таблице 2 особых комментариев не требуют.

Значения критериев согласия экспертов-патологов на четырех этапах работы представлены в таблице 3.

Таблица 3

Значения критерия согласия патологов при оценке атрофии слизистой оболочки желудка

Для определения возможности внедрения в практику патологоанатомического исследования Российского пересмотра OLGA system была изучена воспроизводимость результата среди патологоанатомов разного уровня подготовки. Условно в качестве квалификационной характеристики был принят стаж работы по специальности: выделены группы со стажем менее 2 лет (неопытные) и свыше 5 лет (опытные).

Патологоанатомы со стажем до 2 лет при пересмотре той же коллекции микропрепаратов продемонстрировали низкий разброс индивидуальных значений критерия согласия, но при этом итоговый показатель составил &#;=0,23, что соответствует лишь удовлетворительному (сносному) согласию. Вполне ожидаемым был более высокий уровень согласия (&#;=0,343) в группе стажированных патологоанатомов.

С целью улучшить воспроизводимость патологоанатомического заключения при использовании визуально-аналоговой шкалы Российского пересмотра OLGA system обеим группам патологоанатомов было предложено обучение в форме слайд-семинара и индивидуального тренинга по микропрепаратам. Спустя две недели после завершения образовательной программы обеим группам патологоанатомов была предоставлена для оценки прежняя референтная коллекция микропрепаратов. Расчет критерия согласия продемонстрировал неожиданный и парадоксальный результат: в группе патологоанатомов со стажем до 2 лет итоговый показатель хотя и вырос до &#;=0,370, но все равно укладывался в интервал удовлетворительного (сносного) согласия; а вот в группе стажированных патологоанатомов критерий согласия, наоборот, уменьшился (&#;=0,221) и поменял, соответственно, категорию – вместо бывшего умеренного согласия стал удовлетворительным (сносным).

Полученный методом квадратического взвешивания коэффициент согласия, представляется довольно низким значением (&#;=0,238). Сносная степень согласованности при этом показателе объясняется как довольно неоднородной группой исследователей при огромном с точки зрения каппа статистики количестве экспертов (24 врача-патологоанатома с различным уровнем стажа и профиля повседневной рутинной патоморфологической диагностической работы), так и поставленной задачей перед патологами – без каких-либо элементов обучения новой Международной классификации с использованием визуально-аналоговой шкалы, оценить 4 категории - стадии гастрита (от 0 до IV).

Значимым с нашей точки зрения, является каппа Коэна составивший 0,636 - интегральный показатель уровня согласия 24 практикующих врачей-патологоанатомов, при оценке 2 категорий – наличие и отсутствие атрофии (1 или 0). Значение невзвешенной каппы среди всей группы практикующих патологов находится в том же интервале, что и результаты работы двух предыдущих групп: Международной группы Atrophy Club (&#;=0,73) [14] и отечественных патологоанатомов-экспертов (&#;=0,61) [3,4], которые интерпретируется как хорошая степень согласованности. Сравнивать три значения представляется возможным в связи с бинарной оценкой признака – наличие или отсутствие атрофических изменений слизистой оболочки желудка – не смотря на различную степень профессионализма в отношении морфологической интерпретации гастроэнтерологической патологии и различия в количестве экспертов.

Вполне закономерными выглядят результаты в группах патологов с различным уровнем опыта. Группа опытных патологов показала более высокую степень согласованности, как при оценке стадии хронического гастрита (&#;=0,343), так и в случае оценки серий гастробиоптатов на предмет наличия или отсутствия атрофии (&#;=0,429), по сравнению с 12 менее стажированными врачами-патологоанатомами (&#;=0,231 и &#;=0,701 соответственно). Интересным выглядит разброс показателей в группе неопытных патологов в случае расчета взвешенной квадратической каппы Коэна и невзвешенного критерия согласия. Данное различие указывает на значительно более высокую согласованность в случаях бинарной оценки признака, однако демонстрирует неоднозначную трактовку гистологических маркеров атрофии слизистой оболочки желудка, что соответственно влечет за собой отнесение конкретного клинического случая в разные категории – стадии хронического гастрита.

Наряду с количественным дефицитом желез в слизистой оболочке желудка с обязательным замещением их соединительной тканью, признаком атрофии, по рекомендациям на сегодняшний день, является и качественная утрата желез, выполняющих специализированную функцию в конкретном отделе желудка [8, 9, 14]. В связи с этим нам представляется важным проведение анализа различий в определении стадии хронического гастрита в зависимости от наличия или отсутствия кишечной метаплазии. Достигнутый максимально возможный уровень согласия между врачами-патологоанатомами в клинических случаях с наличием метапластической атрофии достоверно демонстрирует возможность использования кишечной метаплазии как удобного доступного хорошо воспроизводимого маркера атрофии.

Парадоксальный результат – существенное снижение уровня согласованности стажированных патологоанатомов-экспертов, спустя полтора месяца после обучения, в подобного рода исследованиях, принято объяснять проявлением неоднородности группы экспертов. Для обеспечения адекватного результата при этом необходимо прибегать к разбивке групп (перегруппировке) экспертов, к изменению количества участников исследования. Причем, вполне реально предположить ситуацию, при которой, чем выше стаж и больше опыт работы патологоанатома, тем больше у него шансов оказаться в плену неких собственных представлений, умозрительных концепций, не всегда верных. Но чем больше опыт работы, тем выше может оказаться приверженность этим концепциям и образу действий.

Нам представляется важным обсудить еще одну существенную подробность: отечественные патологи не имеют навыков работы с тест-препаратами, как правило, пренебрегают выполнением жесткого алгоритма последовательности действий над объектом. В связи с изложенным, нами предложен метод обучения, основанный на многоуровневом подходе с использованием базы данных референтных изображений (рис.2 ).

Рис. 2. Пример задания учебно-методического комплекса 2 уровня: использование детального описания с обоснованием выбора правильного ответа.

Оценка эффективности разработанного обучающего модульного блока оценена на четвертом этапе путем расчета коэффициента согласия спустя 3-4 недели после обучения 24 врачей-экспертов. Модульный принцип обучения с использованием референтной базы данных позволил существенно повысить критерий согласия (увеличение взвешенной каппы Коэна с 0,226 до 0,436), что соответствует умеренному уровню согласованности.

Маркерный принцип диагностики патологического процесса (болезни) распространен в современной науке, а также в практике диагностических исследований. При этом, высокая надежность теста (признака/маркера) не является достаточным условием для его использования. Необходима оценка валидности признака. Валидность является важнейшей характеристикой признака/маркера, которая характеризует уровень практической пригодности тестовых (признака/маркера) результатов. Для оценки практической пригодности использования выбранных нами гистохимических и иммуногистохимических маркеров атрофии слизистой оболочки желудка (речь идет, разумеется, о косвенных маркерах), нами были использовали принципы текущей критериальной валидности, которая характеризует способность маркерного признака измерять некоторые качества объекта и коррелировать с некоторым референтным внешним критерием, которым для нас является гистологическая характеристика атрофии.

В качестве суррогатных маркеров атрофии были выбраны гистохимические и иммуногистохимические признаки/маркеры, отражающие дефицит желез (гиперплазия гладкомышечных, ретикулярных аргирофильных и эластических волокон), а также изменение клеточного фенотипа (метаплазия кишечная и пилорическая): продукция белка CDX-2 &#; белка мукоцита, вставшего на путь кишечной дифференцировки, продукция, белка Shh &#; условный признак желудочной дифференцировки эпителия, выработка клетками виллина и CD10 &#; белки, ассоциированные со щеточной каемкой, а также ШИК-реакция или диамин железа в сочетании с альциановым синим, продукция слизи, содержащей MUC2 и MUC5AC. Из перечисления маркеров становится понятным, что все они отражают либо замещение желез волокнистыми структурами соединительной ткани или гладкомышечными клетками &#; косвенный показатель абсолютной атрофии, либо изменение желудочного фенотипа: на кишечный либо пилорический (табл. 4).

CDX-2 – белок, являющийся продуктом гена, программирующим кишечную дифференцировку. Ген экспрессируется инициально при увеличении рН просвета желудка, то есть наличии абсолютной или метапластической атрофии [16] в теле желудка. Чувствительность этого белка составляет 86%, специфичность &#; 72%, что позволяет принять его в качестве маркера кишечной метаплазии, а следовательно и атрофии слизистой оболочки желудка.

Таблица 4

Параметры валидности маркеров атрофии слизистой оболочки желудка

Маркер	Se, %	Sp, %	PVP	PVN	LR+, %	LR-, %
CDX-2	86,00	72,00	3,07	0,19	75,44	83,72
Shh градация 2	4,00	98,00	2,00	0,98	66,67	50,52
Shh градация 3-4	14,00	86,00	1,00	1,00	50,00	50,00
Shh градация 6	24,00	32,00	0,35	2,37	26,09	23,63
Shh градация 8	46,00	84,00	2,87	0,64	74,19	60,87
Shh градация более 8	12,00	84,00	0,75	1,05	42,86	48,84
Villin*	72,00	100,00	-	0,28	100,00	78,12
CD10*	72,00	100,00	-	0,28	100,00	78,12
MUC2	72,00	100,00	-	0,28	100,00	78,12
MUC5AC	96,00	0,00	0,96	-	48,98	0,00
Гиперплазия гладкомышечных волокон	48,00	86,00	3,43	0,60	77,42	62,32
Гиперплазия аргирофильных ретикулярных волокон	68,00	92,00	8,50	0,35	89,47	74,19
Гиперплазия эластических волокон	52,00	76,00	2,17	0,63	68,42	61,29
ШИК-реакция (щеточная каемка)	100,00	0,00	1,00	-	50,00	-
Альциановый синий (рН=2,5)	88,00	86,00	6,29	0,14	86,27	87,76
ШИК-реакция и альциановый синий (рН=2,5)	84,00	90,00	8,40	0,18	89,36	84,91
Диамин железа (рН=2,5)	22,00	94,00	3,67	0,83	78,57	54,65
Диамин железа и альциановый синий (рН=2,5)	90,00	84,00	5,62	0,12	84,91	89,36

Примечания:

Se - Чувствительность

Sp - Специфичность

PVP - Прогностическая ценность положительного результата

PVN - Прогностическая ценность отрицательного результата

LR+ - Отношения правдоподобия для положительного результата

LR- - Отношения правдоподобия для отрицательного результата

* - только для полной кишечной метаплазии

Оценка уровня продукции белка Shh традиционно оценивается полуколичественным способом, поэтому в таблице представлены результаты расчета показателей валидности для каждого из интервалов, отражающих этот уровень. Однако, чувствительность и специфичность любого уровня экспрессии данного белка не соответствует категории маркера. Это неудивительно, поскольку Shh не является однозначно трактуемым маркером желудочной дифференцировки. Гиперэкспрессия Shh вполне может отражать появление клеточной линии интенсивно регенерирующего эпителия [11, 12]. Отмечено, что определение гена shh и белка Shh в качестве факторов, обеспечивающих именно желудочную дифференцировку является понятием, справедливым лишь для эмбриогенеза [17]. Повышенная экспрессия Shh может быть ассоциирована с развитием предраковых изменений в виде дисплазии/неоплазии слизистой оболочки желудка, значительно увеличена в опухолевых клетках при раке желудка кишечного типа [12].

Продукция виллина и молекулы CD10 обладают высокими показателями чувствительности и специфичности, однако они характерны только для полной кишечной метаплазии, когда изменение желудочного дифферона включает все типы кишечных клеток, в том числе каемчатые. Подобный тип кишечной метаплазии в наших наблюдениях всегда был ассоциирован только лишь с полной кишечной метаплазией, которая в нашей выборке всегда была связана с фенотипом неполной кишечной метаплазии, что объясняется достаточно искусственным подбором коллекции гастробиоптатов с атрофией слизистой оболочки.

Продукция MUC2 &#; экскрет бокаловидных клеток, характерна для любого типа кишечной метаплазии, что позволяет отнести его к маркерам с высоким уровнем текущей критериальной валидности. Крайне низкая чувствительность маркера MUC5AC не позволяет считать его валидным маркером суррогатной атрофии.

Хотя в авторитетных руководствах по биопсийной диагностике в гастроэнтерологии замещение желез гладкомышечными клетками или волокнистыми структурами соединительной ткани, особенно аргирофильными ретикулярными волокнами, принято считать надежным (почти абсолютным!) признаком атрофии слизистой оболочки при оценке валидности этих показателей/маркеров обнаружены сравнительно низкие значения (табл. 4.).

Маркеры, отражающие гистохимически определяемую муцинпродуцирующую способность клеток, показали свою валидность только в отношении метапластической атрофии. Причем детекция альциановым синим при рН=2,5 секрета бокаловидных клеток характерна для любого типа кишечной метаплазии, однако специфичность этого теста существенно уступает иммуногистохимически определяемой детекции экспрессии MUC2 Тогда как детекция ШИК-позитивной каемки и использование реакции с диамином железа характерны только для соответственно полной (тип I) и неполной толстокишечной (тип III) кишечной метаплазии, повышение валидности этих методов происходит только при комбинировании их с альциановым синим при рН=2,5 (табл.4).

В качестве возможной сферы применения полученных результатов может быть разработка концепции использования принципа гистохимических/ иммуногистохимических маркеров дифференцировки эпителия для оценки стадии хронического гастрита. Маркерный принцип представляется нам более предпочтительным при классической оценке гистопатологических образов (гештальтов) в виду двух обстоятельств: 1) продукция перечисленных белков, хотя и топографически ориентирована на определенные зоны слизистой оболочки, все-таки представляет собой процесс диффузный. Отсюда можно предположить, даже в срезах тангенциальных, не содержащих минимального количества железистых структур, не имеющих мышечной пластинки слизистой оболочки применение маркерного принципа сможет определить уровень атрофических изменений, следовательно, стадию гастрита, и, следовательно, персонифицированный риск рака желудка; 2) как было показано использование единственного критерия атрофии &#; кишечной метаплазии, поднимает уровень согласия экспертов до максимально высоких значений, что и понятно: психологически проще идентифицировать один отчетливый признак, чем интерпретировать сложные образы гистоархитектоники слизистой оболочки желудка.

Выводы

1. При оценке валового патоморфологического материала гастробиопсий на предмет возможности применения стандартов, заданных Российским пересмотром Международной классификации хронического гастрита OLGA-system из 9312 случаев (21 156 биоптатов) пригодны оказались 4,03% (375 диагностических случаев).

2. Причины, препятствующие внедрению современной классификационной системы подразделяются на 2 группы: нарушения стандарта (протокола) эндоскопического забора биопсийного материала (до 54,34%) и нарушения технологии обработки материала гастробиопсии в патологоанатомическом отделении (до 33,19%).

3. При бинарном принципе оценки «есть атрофия / нет атрофии» практикующие патологоанатомы (эксперты) показали уровень критерия согласия, соответствующий 0, 636 (метод невзвешенной каппы Коэна), вполне сопоставимый с аналогичным показателем группы экспертов, дававших оценку международной классификации OLGA-system (каппа коэффициент равен 0,73), а также показателю критерия согласия ведущих российских патологов, оценивавших Российский пересмотр OLGA-system (каппа Коэна составил 0,61). Все три значения коэффициента находятся в одном интервале - от 0,61 до 0,8, что соответствует градации хорошей степени согласованности.

4. Применение традиционных приемов, используемых в дополнительном профессиональном образовании продемонстрировало низкую эффективность: 24 патологоанатома (эксперты) до обучения имели уровень согласия 0,238 (метод взвешенной каппы Коэна), после обучения 0,226 (метод взвешенной каппы Коэна).

5. Модульный принцип обучения с использованием референтной базы данных позволил существенно повысить критерий согласия, (увеличение взвешенной каппы Коэна с 0,226 до 0,436), что соответствует умеренному уровню согласованности и обеспечивает воспроизводимость системы.

6. Оценка маркерного признака &#; наличие бокаловидных клеток (кишечная метаплазия с наличием молекулярной мишени MUC2 или без нее) выявила максимальный критерий согласия экспертов κ&#;1 (метод невзвешенной каппы Коэна), что служит предположением для использования маркерного принципа с целью детекции атрофии слизистой оболочки желудка при хроническом гастрите.

7. Разработка маркерного принципа (детекция молекулярных и клеточных мишеней с оценкой их валидности) позволяет выделить молекулы-кандидаты для последующей разработки диагностической панели биомаркеров атрофии слизистой оболочки желудка при хроническом воспалении.

Литература:

1. Кононов А.В. Воспаление как основа Helicobacter pylori-ассоциированных болезней / А.В. Кононов // Архив патологии. - 2006. - №5. – С.3-10.

2. Кононов, А. В. Сложности простого диагноза «хронически гастрит»: кому это нужно? / А.В. Кононов // Тезисы научных трудов к Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы патологической анатомии». - Санкт-Петербург, 2011. – С. 114-115.

3. Кононов, А. В. Российский пересмотр классификации хронического гастрита: воспроизводимость оценки патоморфологической картины / А. В.Кононов, С. И. Мозговой, А. Г. Шиманская и соавт. // Архив патологии. – 2011. – Т. 73, № 4. – С. 52-55.

4. Мозговой С.И. Российский пересмотр международной классификации хронического гастрита: оценка нового диагностического подхода методами каппа - статистики / С.И. Мозговой, А.Г. Шиманская, И.Л. Осинцева и соавт. // Омский научный вестник. – 2010. - №. 1 (94) – С. 84-88.

5. Мозговой С.И. Алгоритм определения типа кишечной метаплазии слизистой оболочки желудка с помощью комбинированных гистохимических методов / С.И. Мозговой // Архив патологии. - 2009. - № 4 – С. 46-47.

6. Correa P. The gastric precancerous cascade. / P. Correa, M.B. Piazuelo // J. Dig. Dis. – 2012. – Vol. 13(1). – P. 2-9.

Direct repression of Sonic Hedgehog expression in the stomach by Cdx2 leads to intestinal transformation / Mutoh H. [et al.] // Biochem. J. – 2010. – V. 427, №3. –P. 423-434.

Gastritis staging in clinical practice: the OLGA staging system / M. Rugge // Gut. – 2007. – Vol. 56. –/ P. 631–636.

7. Graham D.Y. Eradication of gastric cancer and more efficient gastric cancer surveillance in Japan: two peas in a pod. / D.Y. Graham, M. Asaka // J. Gastroenterol. – 2010. – Vol. 45, №1. P. 1–8.

8. Interobserver variations in histopathological assessment of gastric pathology / Y. Talebkhan [et al.] // Pathology. – 2009. – Vol. 41, №5. – P. 428-432.

9. Morphological and pathologic changes of experimental chronic atrophic gastritis (CAG) and the regulating mechanism of protein expression in rats / L.J. Wang [et al.] // Journal of Zhejiang University. Science. B. – 2006. – Vol. 7, № 8. – P. 634-640.

10. Muscovite reverses gastric gland atrophy and intestinal metaplasia by promoting cell proliferation in rats with atrophic gastritis / L.J. Wang, Q.Y. Zhou, Y. Chen [et al.] // Digestion. – 2009. – Vol. 79, № 2. – P. 79-91.

11. OLGA gastritis staging in young adults and country-specific gastric cancer risk / M. Rugge [et al.] // Int. J. Surg. Pathol. – 2008. – Vol.16, №2. – P.150-154.

OLGA staging for gastritis: A tutorial / M. Rugge [et al.] // Digestive and liver disease. – 2008. – Vol.40, №8. – P.650-658.

OLGA can guard the barn / M. Rugge [et al.] // Am J Gastroenterol. — 2009. — Vol. 104, №12. — P. 3099

12. Overexpression of Cdx2 inhibits progression of gastric cancer in vitro / Y. Xie [et al.] // Int. J. Oncol. – 2010. – Vol. 36, № 2. – P. 509-516.

13. Sonic hedgehog in temporal control of somite formation Resende T.P. [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci U S A. – 2010. – Vol. 107, № 29. – Р. 12907–12919.