На базе ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» были разработаны методики количественного определения антраценпроизводных для корней ревеня тангутского и корней ревеня лекарственного. Для подтверждения правильности разработанных методик был проведен расчет валидационных характеристик. Результаты проведенных исследований позволили установить, что разработанные спектрофотометрические методики определения суммы антрпаценпроизводных в фармакопейных растениях достаточно воспроизводимы, линейны в исследуемом диапазоне концентраций, непродолжительны по времени выполнения, доступны, для их выполнения не требуется дорогостоящих реактивов. С использованием разработанной методики проанализирован ряд промышленных корней ревеня тангутского и ревеня лекарственного и показано, что содержание суммы антраценпроизводных в образцах сырья варьирует в пределах от 2,85 % до 3,00 % в ревене тангутском и от 2,64 % до 2,80 % в ревене лекарственном (в пересчете на франгула-эмодин).
Ключевые слова: антраценпроизводные, франгула-эмодин, ревень тангутский, ревень лекарственный, спектрофотометрия.
Антраценпроизводные являются одной из основных действующих групп биологически активных соединений корней ревеня. Ревень тангутский (Rheum palmatum L.) является фармакопейным производящим растением для лекарственного растительного сырья корни ревеня Radices rhei, в то время как ревеня лекарственный-близкородственный вид, корни которого также содержат антраценпроизводные. На базе ФГБОУ «Оренбургский государственный медицинский университет» были разработаны методики количественного определения антраценпроизводных в корнях данных растений. Обе методики предусматривают спектрофотометрическое определение суммы антраценпроизводных в пересчете на франгула-эмодин при длине волня 510нм. Условия экстрагирования: для ревеня тангутского-экстрагент 70 % спирт этиловый, соотношение сырье-экстрагент 1 к 100, время настаивания на водяной бане 30минут + 15 минут в ультразвуковой ванне; для ревеня лекарственного- экстрагент 60 % спирт этиловый, соотношение сырье-экстрагент 1 к 100, время настаивания на водяной бане 30минут + 15 минут в ультразвуковой ванне. Для подтверждения разработанных методик была проведена их валидация.
Валидация аналитической методики — это экспериментальное доказательство того, что методика пригодна для решения предполагаемых задач. Валидационные характеристики методики спектрофотометрического определения антраценпроизводных нами были определены по следующим показателям: линейности, прецизионности (повторяемости, внутрилабораторной прецизионности, межлабораторной прецизионности), правильности,специфичности, а также аналитической области [1,2,3]. Определение линейности проводили на 5 уровнях концентраций от теоретического содержания суммы антраценпроизводных в пересчете на франула-эмодин в исследуемых объектах (табл.1 рис.1,2). Растворы готовили путем разбавления аликвоты и увеличения аликвоты для измерения количественного содержания суммы антраценпроизводных в пересчете на франгула-эмодин в растворах, имеющих концентрацию 50,75, 100, 125 и 150 %. Критерием приемлемости линейности является коэффициент корреляции. Если его величина близка к единице, то совокупность данных можно описать прямой линией. Величина коэффициента корреляции должна быть не ниже 0,99. Специфичность валидируемой методики может быть доказана также соответствующей статистической обработкой результатов анализов реальных объектов, которая представлена метрологическими характеристиками (табл.3–4). Аналитическая область методики может быть установлена по диапазону экспериментальных данных, удовлетворяющих линейной модели(табл.1 рис.1–2).
Таблица 1
Определение линейности методики
|
№ измерения |
Аликвота, % |
Аликвота, мл |
Оптическая плотность, D |
Содержание антраценпроизводных в аликвоте, С,% |
|
Корни ревеня тангутского |
||||
|
1 |
50 |
0,5 |
0,1215 |
1,48 |
|
2 |
75 |
0,75 |
0,1811 |
2,12 |
|
3 |
100 |
1 |
0,2439 |
3,00 |
|
4 |
125 |
1,25 |
0,3049 |
3,73 |
|
5 |
150 |
1,5 |
0,3659 |
4,47 |
|
Корни ревеня лекарственного |
||||
|
1 |
50 |
0,5 |
0,1121 |
1,37 |
|
2 |
75 |
0,75 |
0,1685 |
2,06 |
|
3 |
100 |
1 |
0,2255 |
2,80 |
|
4 |
125 |
1,25 |
0,2820 |
3,45 |
|
5 |
150 |
1,5 |
0,3378 |
4,13 |
Рис. 1. График зависимости оптической плотности извлечения из корней ревеня тангутского от концентрации
Рис. 2. График зависимости оптической плотности извлечения из корней ревеня лекарственного от концентрации
Данные для расчета коэффициента корреляции представлены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2
Данные для расчета коэффициента корреляции
|
D |
C |
DC |
D2 |
C2 |
|
Корни ревеня тангутского |
||||
|
0,1215 |
1,48 |
0,18 |
0,0148 |
2,19 |
|
0,1811 |
2,12 |
0,38 |
0,0328 |
4,49 |
|
0,2439 |
3,00 |
0,73 |
0,0595 |
9,00 |
|
0,3049 |
3,73 |
1,14 |
0,0930 |
13,91 |
|
0,3659 |
4,47 |
1,64 |
0,1339 |
19,98 |
|
∑D=1,2173 |
∑C=14,8 |
∑DC=4,07 |
∑D2=0,334 |
∑C2=49,57 |
|
Корни ревеня лекарственного |
||||
|
0,1121 |
1,37 |
0,1536 |
0,0126 |
1,8769 |
|
0,1685 |
2,06 |
0,3471 |
0,0284 |
4,2436 |
|
0,2255 |
2,80 |
0,6314 |
0,0509 |
7,84 |
|
0,2820 |
3,45 |
0,9729 |
0,0795 |
11,9025 |
|
0,3378 |
4,13 |
1,3951 |
0,1141 |
17,0569 |
|
∑D=1,1259 |
∑C=13,81 |
∑DC=3,50 |
∑D2=0,2855 |
∑C2=42,9499 |
Таблица 3
Расчет коэффициента корреляции
|
Объекты исследования |
SSх = ΣD 2- (ΣD) 2 /5 |
SSy = ΣC 2— (ΣC) 2 /5 |
SPху = ΣDC-(ΣD· ΣC)/5 |
r = SPху / √ SSх· SSy |
|
Корни ревеня тангутского |
0,23 |
33,89 |
2,79 |
0,999 |
|
Корни ревеня лекарственного |
0,20 |
29,55 |
2,41 |
0,991 |
где SSх — сумма квадратов отклонения баллов (D) испытуемых от среднего
арифметического;
SSy — сумма квадратов отклонения баллов (C) испытуемых от среднего
арифметического;
SPху — сумма попарных произведений;
r — коэффициент корреляции.
Коэффициенты корреляции для исследуемых объектов составили более 0,99 (табл. 3). Следовательно, можно сказать, что методика является линейной. Для определения повторяемости методики брали один образец сырья и проводили исследование в 11 повторностях. Определяли величину относительного стандартного отклонения, которая не должна превышать 10 %. Для корней ревеня тангуского эта величина составила 3,30 % (таблица 4), для корней ревеня лекарственного — 4,5 % (таблица 5).
Таблица 4
Метрологические характеристики методики количественного определения суммы антраценпроизводных всырье ревеня тангутского
|
f |
|
S |
P, % |
t (P,f) |
X |
E, % |
|
10 |
2,99 |
0,04472 |
95 |
2,23 |
±0,100 |
±3,30 |
Таблица 5
Метрологические характеристики методики количественного определения суммы антраценпроизводных всырье ревеня лекарственного
|
f |
|
S |
P, % |
t (P,f) |
X |
E, % |
|
10 |
2,7 |
0,05477 |
95 |
2,23 |
±0,122 |
±4,5 |
Для определения внутрилабораторной прецизионности методики брали 3образца сырья и исследовали в трех повторностях двумя исследователями (таблица 6-7). Определяли величину относительного стандартного отклонения,которая не должна превышать 15 %.
Таблица 6
Результаты определения внутрилабораторной прецизионности разработанной методики для корней ревеня тангутского
|
Повторность |
Содержание антраценпроизводных в пересчете на франгула-эмодин в корнях ревеня тангутского, % |
|||
|
Аналитик 1 |
Сырье 1 |
Сырье 2 |
Сырье 3 |
|
|
1 |
2,99 |
2,98 |
3,06 |
|
|
2 |
3,05 |
3,03 |
2,98 |
|
|
3 |
3,01 |
3,04 |
3,03 |
|
|
4 |
Аналитик 2 |
3,04 |
3,01 |
3,00 |
|
5 |
2,96 |
2,96 |
2,99 |
|
|
6 |
2,97 |
3,03 |
3,07 |
|
|
Среднее значение |
3,00 |
3,01 |
3,03 |
|
|
Относительное стандартное отклонение (%) |
±3,67 |
±3,19 |
±3,76 |
|
Таблица 7
Результаты определения внутрилабораторной прецизионности разработанной методики для корней ревеня лекарственного
|
Повторность |
Содержание антраценпроизводных в пересчете на франгула-эмодин в корнях ревеня лекарственного, % |
|||
|
Аналитик 1 |
Сырье 1 |
Сырье 2 |
Сырье 3 |
|
|
1 |
2,72 |
2,72 |
2,80 |
|
|
2 |
2,68 |
2,76 |
2,75 |
|
|
3 |
2,75 |
2,83 |
2,81 |
|
|
4 |
Аналитик 2 |
2,69 |
2,84 |
2,70 |
|
5 |
2,66 |
2,82 |
2,77 |
|
|
6 |
2,71 |
2,81 |
2,71 |
|
|
Среднее значение |
2,70 |
2,80 |
2,76 |
|
|
Относительное стандартное отклонение (%) |
±3,19 |
±4,67 |
±4,55 |
|
Проведенные нами исследования показали, что относительное стандартное отклонение не превышает 15 %, что свидетельствует о том, что разработанные методика воспроизводима в указанных условиях.
Для определения межлабораторной прецизионности методики определяли количественное содержание образцов сырья на трех спектрофотометрах Specord40 (Analytik Jena), СФ-2000, UNICO 2800 (таблица 8). Определяли величину относительного стандартного отклонения, которая не должна превышать 15 %.
Таблица 8
Результаты определения межлабораторной прецизионности разработанной методики для корней ревеня тангутского иревеня лекарственного
|
Анализируемое лекарственное растительное сырье |
Содержание антраценпроизводных в пересчете на франгула-эмодин (корни ревеня тангутского и ревеня лекарственного), % |
Относи- тельное стан- дартное отклонение (%) |
||
|
Спектро- фотометр - Specord 40 (Analytik Jena) |
Спектро- фотометр - СФ-2000 |
Спектро- фотометр - UNICO 2800 |
||
|
Корни ревеня тангутского |
3,03 |
2,95 |
3,01 |
±4,16 |
|
Корни ревеня лекарственного |
2,87 |
2,81 |
2,78 |
±4,58 |
При определении правильности методики устанавливали содержание антраценпроизводных в пересчете на франгула-эмодин в извлечениях, полученных при добавлении определенного количества 0,25 мл, 0,50мл, 0,75 мл рабочего стандартного раствора (франгула-эмодина) к полученному нами извлечению для получения различных концентраций. Критерием приемлемости методики является величина среднего процента восстановления при применении растворов определенных концентраций, скорректированная на 100 %. Средняя величина критерия приемлемости определяется рамками 100±5 %.
Таблица 9
Результаты определения правильности методики (эксперименты сдобавками франгула-эмодина) для ревеня тангутского иревеня лекарственного
|
№ |
Содержани е антрацен- производны х мг, в пересчете на франгула-эмодин |
Добавле —но РСО Франгула-эмодина, мг |
Ожидаемо е содержа- ние, мг |
Получе н-ное содержа ние, мг |
Получе н-ная ошибка, % |
Статистическ ие характеристик и |
|
Корни ревеня тангутского |
||||||
|
1 |
3,00 |
0,125 |
3,125 |
3,123 |
99,9 |
S =1,9248
E =±4,3 % |
|
2 |
3,00 |
0,125 |
3,125 |
3,120 |
99,8 |
|
|
3 |
3,00 |
0,125 |
3,125 |
3,11 |
99,5 |
|
|
4 |
3,00 |
0,250 |
3,25 |
3,22 |
99,0 |
|
|
5 |
3,00 |
0,250 |
3,25 |
3,3 |
99,3 |
|
|
6 |
3,00 |
0,250 |
3,25 |
3,34 |
102,7 |
|
|
7 |
3,00 |
0,375 |
3,375 |
3,385 |
100,3 |
|
|
8 |
3,00 |
0,375 |
3,375 |
3,367 |
99,7 |
|
|
9 |
3,00 |
0,375 |
3,375 |
3,42 |
101,3 |
|
|
Средняя ошибка 100,2 % |
||||||
|
Корни ревеня лекарственного |
||||||
|
1 |
2,80 |
0,125 |
2,925 |
2,921 |
99,8 |
S =1,9118
E =±4,2 % |
|
2 |
2,80 |
0,125 |
2,925 |
2,917 |
99,7 |
|
|
3 |
2,80 |
0,125 |
2,925 |
2,919 |
99,8 |
|
|
4 |
2,80 |
0,250 |
3,05 |
3,1 |
101,6 |
|
|
5 |
2,80 |
0,250 |
3,05 |
3,032 |
99,4 |
|
|
6 |
2,80 |
0,250 |
3,05 |
3,15 |
103,2 |
|
|
7 |
2,80 |
0,375 |
3,175 |
3,22 |
101,4 |
|
|
8 |
2,80 |
0,375 |
3,175 |
3,169 |
99,8 |
|
|
9 |
2,80 |
0,375 |
3,175 |
3,28 |
103,3 |
|
|
Средняя ошибка 100,8 % |
||||||
=100,2 %
X =±4,2938
Проведенные исследования показали, что процент восстановления в разработанной методике для ревеня тангутского и ревеня лекарственного варьирует от 99,0 % до 102,7 %,и от 99,4 % до 103,3 % соответственно, при этом средняя величина его составила 100,2 % для ревеня тангутского и 100,8 % для лекарственного. Как видно из данных, приведенных в таблице 8, в разработанной методике отсутствует систематическая ошибка, относительная ошибка при доверительной вероятности 95 % не превышает ±4,3 % для ревеня тангутского и ±4,2 % для ревеня лекарственного (табл.8).Результаты проведенных исследований позволили установить, что разработанные спектрофотометрические методики определения суммы антрпаценпроизводных в фармакопейных растениях достаточно воспроизводимы, линейны в исследуемом диапазоне концентраций, непродолжительны по времени выполнения, доступны, для их выполнения не требуется дорогостоящих реактивов. С использованием разработанной методики проанализирован ряд промышленных корней ревеня тангутского и ревеня лекарственного и показано, что содержание суммы антраценпроизводных в образцах сырья варьирует в пределах от 2,85 % до 3,00 % в ревене тангутском и от 2,64 % до 2,80 % в ревене лекарственном (в пересчете на франгула-эмодин) (табл. 10).
Таблица 10
Содержание суммы антраценпроизводных вразличных образцах корней ревеня тангутского иревеня лекарственного
|
№п/п |
Характеристика образца сырья |
Содержание суммы антраценпроизводных в пересчете на абсолютно сухое сырье и франгула-эмодин,% |
|
1 |
Корни ревеня тангуского (Rheum palmatum L.), заготовленные в сентябре 2016 г. в р. Башкортостан. |
2,87±0,11 |
|
2 |
Корни ревеня тангуского (Rheum palmatum L.), заготовленные в сентябре 2017 г. в р. Башкортостан. |
2,85±0,09 |
|
3 |
Корни ревеня тангуского (Rheum palmatum L.), заготовленные в сентябре 2018 г. в р. Башкортостан. |
3,00±0,13 |
|
Корни ревеня лекарственного |
||
|
1 |
Корни ревеня лекарственного (Rheum officinale B.), заготовленные в сентябре 2016 г. в р. Крым |
2,68±0,05 |
|
2 |
Корни ревеня лекарственного (Rheum officinale B.), заготовленные в сентябре 2017 г. в р. Крым |
2,64±0,08 |
|
3 |
Корни ревеня лекарственного (Rheum officinale B.), заготовленные в сентябре 2018 г. в р. Крым |
2,80±0,05 |
Литература:
- Indian Pharmacopoeia Commission Volume III Sector-23, Raj Nagar, Ghaziabad-201 002, India, 2010.-1112.
- Pharmacopoeia of the peoples Republic of China Volume I, 2005.-975.
- Государственная фармакопея Российской Федерации: Вып. 1. / МЗ РФ. 14-е изд. — М.: Медицина, 2018. — 3262 с.
