Цитохромоксидазная активность печёночной паренхимы при обтурационной желтухе и токсических повреждениях



Актуальность. В настоящее время известны способы диагностики острых и хронических заболеваний печени, основанные на определении активности различных ферментов в крови и печёночной ткани, скорости поглощения красителей и радиоактивных веществ, по уровню метаболитов, синтезируемых данным органом [1,2,3,5,7]. Однако ни один из этих тестов диагностики не даёт представления о количестве сохранных и функционально-способных клеток паренхимы печени, а позволяет только составить качественные представления о патологическом процессе в данном органе.

В то же время такой диагностический тест необходим в гепатологии, он позволял бы объективно представлять состояние печёночной паренхимы в каждом конкретном случае, обоснованно подходить к выбору метода лечения и объёма хирургического вмешательства, его патогенетической обоснованности и адекватного течения послеоперационного периода [4].

Материал иметоды исследования.

Для решения поставленной задачи выполнены острые и хронические опыты на 200 крысах –самцах весом 160–180 грамм,46 собаках различного веса и пола. Кроме того, подвергнуты обследованию 24 больных с заболеваниями гепатобиллиарной зоны.

Избрав в качестве основного направления работы изучение митохондриальной дыхательной цепи, ответственной за энергетику печёночной клетки и потребляющей 90 % кислорода, поступающего в клетку,мы исследовали активность цитохромокси дазы (цитохром а +а3).Последняя изучалась нами в присутствии двух субстратов: цитохром с –природным донором электронов и NNNN тетраметил-парафенилендиамином (ТМФД)-искусственным донором электронов. Необходимость такого методического приёма обусловлена тем, что восстановленный цитохром С передаёт электроны цитохромоксидазному олигоферментному комплексу, который активирует кислород с образованием ОН- через цитохром а3. Восстановленный же ТМФД окисляется через цитохромы а+а3, локализованных на внутренней митохондриальной мембране (Jacob E/E.,1960).

Для измерения активности цитохромоксидазы в присутствии ТМФД и цитохрома С забирали кусочек органа и в гомогенизаторе Даунса приготовляли гомогенат в среде, состоящей из 0,25 М сахарозы,2х10 -4 ЭДТА,0,01 М трис- Нсl буфера (рн-7,6–7,8). Соотношение ткани печени и среды составляло 1:2 вес/объём. Полярографический анализ на ЛП-7 (ЧССР) проводили со стандартным платиновым электродом Кларка закрытого типа.

В полярографическую кювету объёмом 1,1 мл.(t=37 С) вносили полученный гомогенат в расчёте 1,4 мг. белка на данный объём кюветы. После чего записывали скорость потребления кислорода. Аналогичные записи проводили при последовательном добавлении в полярографическую кювету аскорбата натрия-конечная концетрация 2мм.,ТМФД и цитохром С в конечной концентрации 1мкм и 5 мкм соответственно.

Рассчитывали цитохром С- и ТМФД-оксидазные активности на 1 мг. Белка за вычетом аскорбат зависимого потребления кислорода.

Результаты иих обсуждение.

Токсическоеповреждение печени вызывали у крыс путём введения ДL-галактозамина и четыреххлористого углерода. Затравка крыс галактозамином в дозе 150 мг./100 гр. приводили к гибели всех животных через 56 часов наблюдения. При этом две трети из них погибают в первые двое суток. У животных нарастает клиническая картина острой печёночной недостаточности. К данному периоду наблюдения они становятся адинамичными, шерсть взъерошена, животные не пьют воду, реакция на болевой раздражитель снижена и замедлена. Через 48 часов затравки печень животных имеет глинистую окраску, дряблая, даёт обильный соскоб

.

Таблица 1

Активность ТМФД-и цитохром-С-оксидаз (в нмоль О2 мин-1 мг-1) в печени животных, затравленных галактозамином

Период исследования	Аскорбат-зависимое потребление О	ТМФД-оксидазная активность	Цитохром-С оксидазная активность	Отношение цитохром-С /ТМФД-оксидазных активностей
Исходные данные	10,5±0,15 N=5	20,0±1,5 N=5	27,9±3, N=5	1,9±0,05 N=5
12 часов затравки В % к исходн.	17,1±0,98 N=5 Р 0,005 162,8 %	21,9±1,1 N=5 Р 0,05 109,5 %	41,8±3,5 N=5 Р 0,01 149,8 %	5,00±0,005 N=5 265,8 %
18 В % к исходн.	13,1±0,6 N=5 Р 0,005 124,7 %	17,0±0,6 N=5 Р 0,05 85,0 %	40,1±1,16 N=5 Р 0,01 143,7 %	6,94±0,05 N=5 365,3 %
24 В % к исходн.	13,5±0,6 N=5 Р 0,05 128,6 %	15,9±0,6 N=5 Р 0,01 79,5 %	36,8±0,6 N=5 Р 0,01 131,9 %	9,7±0,15 N=5 510 %
48 В % к исходн.	13,0±0,4 N=5 Р 0,05 123,8 %	15,1±0,8 N=5 Р.01 75,5 %	39,8±4,4 N=5 Р 0,01 139,8 %	13,2±1, N=5 694,8 %

Из данных, представленных в таблице 1, следует, что ТМФД-оксидазная активность к 12 часам наблюдения практически сохраняет тот же уровень, который имеется в интактной печени. Однако активность цитохром-С-оксидазы статистически достоверно возрастала в 1,5 раза. Коэффициент или отношение указанных активностей достигает 5,0-+0,05 ед. Такая динамика позволяет предположить, что к 12 часам происходят какие-то изменения в дыхательной цепи транспорта электронов митохондрий. Они могут быть связаны как с терминальной оксидазой-митохондрий, так и с дыхательным комплексом, окисляемым ТМФД. Последнее предположение более вероятно, поскольку добавление экзогенного цитохрома-С,т. е. реконструкция дыхательной цепи приводит к увеличению обращаемости циклов в митохондриальных электронно-транспортных комплексах дыхательных ферментов митохондрий. Возрастание ТМФД-оксидазной активности является отражением каких-то изменений, происходящих с эндогенным цитохромом-С.

Через 18 часов затравки Д –галактозамином активность ТМФД-оксидазы начинает статистически достоверно падать. И в последующие сроки наблюдения (24 и 48 часов) такое снижение достигает наибольших величин (24,5 %) по сравнению с контрольными данными. В эти-же периоды исследования сохраняется повышенный уровень цитохром-С-оксидазы. Причём по сравнению с интактными животными такое увеличение колеблется в пределах 31,9–43,7 %.

Следовательно, у крыс с такой продолжительностью затравки галактозамином через 18 часов исследования можно считать пороговыми, хотя потребление кислорода возрастает при добавлении экзогенного цитохрома-С практически на ту же величину. ТМФД оксидазная активность снижается не только за счёт изменений происходящих в цитохроме-С дыхательной цепи, но и деградации цитохрома а+а3.

В таблице № 2 представлены результаты опытов у животных, затравленных четырёххлористым углеродом.

Таблица 2

Период исследования	Аскорбат-зависимое потребление О2	ТМФД-оксидазная активность	Цитохром-С-ок сидазная активность	Отношение цитохром-С/ТМФД-оксид.активностей
Исходные данные	10,5±0,15 N=5	20,0±1,5 N=5	27,9±3,0 N=5	1,9±0,05 N=5
12 часов затравки В % к исход.	13,7±0,36 N=5 Р 0,01 130,5 %	21,9±0,4 N=5 Р 0,05 109,5 %	73,2±3 N=5 Р 0,01 262,4 %,0	7,2±0,05 N=5 378,9 %
24 часа затравки В % к исход.	11,8±0,4 N=5 Р 0,01 112,4 %	14,8±0,4 N=5 Р 0,01 74,0 %	65,9±2,0 N=5 Р 0,01 236,2 %	10,9±0,4 N=5 573,7 %

Они указывают на то, что к 12 часам исследования активность ТМФД-оксидазы статистически достоверно не меняется. К 24 часам после затравки это падение существенно и составляет 26 % от исходного уровня. В данной группе опытов, как и в экспериментах с Д –галактозамином, имеет место аналогичная динамика. Только в случаях затравки четырёххлористым углеродом в дозе 0,25 мл./100 гр. веса, критический момент сдвинут к 12 часам исследования.

Цитохром-С-оксидазная активность к этому периоду возрастает в 2,6 раза и степень практически такого же увеличения (2,4 раза) сохраняется к 24 часам после затравки. Хотя мы имеем однонаправленную интенсификацию потребления кислорода при добавлении экзогенного цитохрома-С при введении животным галактозамина и четырёххлористого углерода, интенсивность их различна. Причина подобного различия нуждается в дополнительном исследовании и, возможно, определяется спецификой их действия. В этом по-видимому немаловажное значение имеет то, что точкой приложения действия галактозамина в большей степени являются плазматические мембраны гепатоцитов…

Это приводит к более быстрой деградации переносчика дыхательной цепи, структурированного во внутренней мембране митохондрий, экзогенного цитохрома-С и возможно цитохрома а + а3. Возможно, повреждения митохондриальных мембран наиболее выражено при затравке галактозамином. Хотя в условиях поражения четырёххлористым углеродом возможно ожидать увеличение роли свободного окисления, т. е. реакций, конкурирующих за кислород.

В более поздние сроки затравки Сс 4,когда отчётливо выражена картина структурных нарушений гепатоцитов, а, соответственно, и митохондрий его, активность цитохрома-С-оксидазы падает почти до уровня, который имеется у животных, начиная с 12-часового периода исследования после затравки галактозамином. Так, через 36 часов и 48 часов после введения Сс 4 активность цитохром-С-оксидазы составляет соответственно 48,8±1,3 и 46,7±1,1 нмоль±0,25 и 17,4±0,3 нмоль О2 /мин.-1 мг.-1 белка. Причём уровень последней статистически достоверно не отличался от того, который имеется у животных, затравленных галактозамином, в течение 18–48 часов (р 0,005,n=5).

Стремясь использовать более чистую модель повреждения паренхимы печени, мы использовали ишемию.

Таблица 3

Активность ТМФД-и цитохром-С-оксидаз вишемизированной печени животных

Период исследования	Аскорбат-зависимое потребление О2	ТМФД-оксидазная активность	Цитохром-С-ок сидазная активность	Отношение цитохром-С/ТМФД-оксид.активностей
Исходные данные	10,5±0,15 N=5	20,0±1,5 N=5	27,9±3,0 N=5	1,9±0,05 N=5
30 минут Ишемии В % к исход.	10,5±0,26 N=5 Р 0,05 100,0 %	16,5±0,45 N=5 Р 0,01 82,5 %	28,6±0,86 N=5 Р 0,05 102,5 %	3,0 N=5 157,9 %
60 минут Ишемии В % к исход.	12,0±0,8 N=5 Р 0,05 114,3 %	15,7±0,9 N=5 Р 0,01 78,5 %	33,8±2,6 N=5 Р 0,05 121,0 %	5,9±0,06 N=5 310,5 %
120 минут Ишемии В % к исход.	11,2±0,36 N=5 Р 0,05 106,7 %	15,9±0,9 N=5 Р 0,01 79,5 %	49,7±6.3 N=5 Р 0,01 178,1 %	.8,1±0,07 N=5 426,4 %

Как следует из таблицы № 3, лишение печени кислородом в условиях нормотермии почти не приводило к изменению аскорбат-зависимого потребления кислорода. ТМФД-оксидазная активность снижается наиболее существенно к 60 минутам ишемии (на 21,5 %) и сохраняется практически такой через 120 минут исследования. Уровень её, начиная с 60 минут возрастает в 1,2 раза и продолжается нарастать к 120 минутам ишемии. Через 180 минут лишения печени кровотока цитохром-С-оксидазная активность возрастает в 2,4 раза (достигает 67,3±2,8 нмоль О2/мин.-1 белка (р0,01,n=5).

Интересные данные были получены нами в группе опытов с обтурационной желтухой. Лигирование общего желчного протока приводило к тому, что через 7 суток возрастала активность цитохромоксидазы при добавлении субстратов: ТМФД и цитохрома-С. Если ТМФД-оксидазная активность увеличивалась только в 1,4 раза, то цитохром-С-оксидазная активность возрастала значительно (в 3,1 раза).Возросший уровень последней сохраняется при продолжительности обтурационной желтухи 14 и 21 сутки. В эти периоды исследования прослеживается и более высокая активность ТМФД-оксидазы. Оно в 2,4 раза больше по сравнению с интактными животными и в 1,7 раза выше крыс, у которых обтурационная желтуха длительностью 7 суток.

В данной группе опытов, как и в предыдущих оказалось, что 7 суток оказались критическим сроком. И действительно имела место иктеричность лап и ушных раковин, сниженная реакция на болевые раздражители, взъерошенная шерсть, выделения сукровицы из носа. При вскрытии животных отмечалось кровоизлияние в брыжейку, плевральную полость. Печень их была лимонно-желтого цвета и мягкой консистенции.

Обобщая данные, полученные нами в процессе моделирования разнообразных патологических процессов в печени следует отметить, что абсолютные значения активностей терминальной оксидазы митохондрий подвержены значительным колебаниям. Размах последних не поддаётся контролю, поскольку, как и активность других ферментов, комплексы митохондриальной дыхательной цепи подвержены гинетическому, гормональному и другим известным видам контроля. В силу этого было бы методической ошибкой рекомендовать и использовать в практической гепатологии полученные нами уровни активности цитохромоксидазы, определяемые с помощью ТМФД и цитохрома-С, в оценке степени повреждения паренхимы печени при различных патологических состояниях.

Предположение о том,что изменения активности цитохромоксидазного комплекса при использовании в качестве субстрата ТМФД обусловлены повреждением митохондриальных мембран и изменениями, происходящими с таким дыхательным переносчиком, как цитохром-С. Причины таких изменений могут быть различны и связаны как с деградацией самого фермента, так и с солюбилизацией и выходом в матрикс гепатоцита из внутренней митохондриальной мембраны. И действительно добавление экзогенного цитохрома-С в значительной степени восстанавливает цитохромоксидазную активность. Данный факт явился основой для предположения о том, что отношение цитохром-С и ТМФД-оксидазных активностей будет служить индикатором степени повреждения митохондриальных мембран и деградации локализованных во внутренней мембране этих субклеточных структур дыхательных переносчиков.

Вычисление этого отношения или коэффициента показало, что при затравке животных Д –галактозамином его числовое значение растёт во все периоды исследования (см.табл.1). Особенно интенсивное увеличение коэффициента происходит в течении первых 18–24 часа. В этот период наблюдения он в 3,6–5,1 раза превышает данные, имеющиеся в интактной печени и достигает 6,9–9,7 единиц. После 24 часа начинается гибель подопытных животных. К 48 часам исследования из 23 крыс погибает 10 крыс, т. е. практически половина. Значения коэффициента продолжают нарастать, хотя и менее интенсивно, и к 48 часам достигают 13,2±1,0 ед. И параллельно имеет место гибель всех животных к 56 часам затравки галактозамином (ЛД=100).

Практически тот же угол наклона имеет графическая кривая значений коэффициента в течении первых 24 часов после затравки Ссл4. После этого периода, в отличие от затравки галактозамином, уровень отношения цитохром-С/ТМФД-оксидазных активностей начинает снижаться (см.табл.2) и к 36 и 48 часам исследования достигает соответственно 7,1±0,04 и 6,0±0,04 единицы. Оказалось, что к 24 часам погибает половина животных (23 из 48 крыс). Остальные животные, у которых коэффициент составлял 6 единиц, выжили и остались жить продолжительное время после затравки Ссл4.

Аналогичная картина прослеживается у животных с механической желтухой.

Таблица 4

Активность ТМФД-и цитохром-С-оксидаз гомогенатов печени животных собтурационной желтухой

Период исследования	Аскорбат зависимое потребление О2	ТМФД-оксидазная активность	Цитохром-С-оксидазная активность	Отношение цит.-С/ТМФД-оксидазных активностей
Исходные данные	10,5±0,15 N=5	20,0±1,5 N=5	27,9±3,0 N=5	1,9±0,05 N=5
7 суток обтурационной желтухи В % к исход.	20,8±0,8 N=5 Р 0,01 198,1 %	27,8±0,9 N=5 Р 0,02 139,0 %	87,9±2,5 N=5 Р 0,01 315,0 %	9,8±0,3 N=5 Р 0,01 515,8 %
14 суток обтурационной желтухи В %	37,7±0,9 N=5 Р 0,01 359,0 %	47,5±0,8 N=5 Р 0,01 237,5 %	95,7±0,6 N=5 Р 0,01 343,0 %	5,9+_006 N=5 Р 0,01 310,5 %
21 суток обтурационной желтухи В % к исход.	22,9±0,7 N=5 Р 0,01 218,1 %	32,1±1,1 N=5 Р 0,01 160,5 %	73,8±4,5 N=5 Р 0,01 264,5 %	5,5±0,05 N=5 Р 0,01 289,5 %

Виден тот же интенсивный рост коэффициента в течение первых 7 дней наблюдения. И этот срок оказался критическим, после которого из 37 крыс погибло 22 животных, т. е. 59,4 %. Остальные животные выжили и были выведены из опыта через два месяца. У них к 14 и 21 суткам исследования коэффициент составлял соответственно 5,9±0,06 и 5,5±0,05 единиц (см.таблицу 4). При вскрытии этих животных в указанные сроки имела место реканализация протока и восстановление оттока желчи из печени [Сахипов С. Ж. М.,1983].

Данные, изложенные выше, с очевидностью указывают на то, что те животные, которые имеют значения коэффициента выше 7–8 ед., погибают. Следовательно, такие значения позволяют диагностировать тяжелейшую форму структурно-функциональных нарушений в печени в результате патологического процесса. Причём специфика этого процесса не имеет значения.

Однако такой подход к диагностике состояния паренхимы печени не давал представлений о количественной характеристике степени повреждения печёночной паренхимы. Для решения этой задачи мы приняли методический подход основанный на установлении в каждом конкретном случае корреляционного взаимоотношения между величиной коэффициента и количеством жизнеспособных гепатоцитов. Последний показатель устанавливался нами в биопсированных кусочках ткани печени, когда одна часть его использовалась для определения соотношения цитохром-С и ТМФД-оксидазных активностей, а другая — для разделения на клетки. Жизнеспособные гепатоциты идентифицировались по прокрашиванию витальным красителем-трипановым синим и подсчитывались в камере Горяева.

Из таблицы № 5 следует, что существует обратная зависимость величин коэффициента и количеством жизнеспособных гепатоцитов. Если у интактных животных из грамма печени выделяется 1.9х10 в 7степени жизнеспособных гепатоцитов, то при коэффициенте 6.94 сохранным остаётся только 35 % клеток.

Таблица 5

Показатели коэффициента иколичества жизнеспособных гепатоцитов укрыс, затравленных галактозамином

№	Отношение цитохромС/ТМФД-оксид. активностей (в ед.)	Количество жизнеспособных гепатоцитов вгр.печени	Процент жизнеспособных гепатоцитов
1	5,05±0,05 n=5	(0,85±0,02)х107	45
2	6,94±0,05 n=5	(0,67±0,02)х107	35
3	9,7±0,15 n=5	(0,45±0,01)х107	24
4	13,2±1,0 n=5	(0,30±0,02)х107	16

Интересные данные были получены нами на клиническом материале. У больных с различными хирургическими заболеваниями, а также заболеваниями печени и желчных путей проводили биопсию печени. Биопсированный материал подвергался такому же анализу, как и эксперименте на лабораторных животных. На таблице 6 представлены значения коэффициента и процента жизнеспособных гепатоцитов.

Таблица 6

Данные коэффициента ипроцента жизнеспособных гепатоцитов уживотных сразличными моделями гепатоцеллюлярного повреждения иу больных сзаболеваниями гепатобилиарной системы

№	Экспериментальные данные (крысы, собаки)		Клинический материал (хирургические больные)
	Коэффициент (в ед)	Процент жизнеспо­собных гепатоцитов	Коэффициент (в ед)	Процент жизнеспо­собных гепатоцитов
1	1,9–2,0	95–100	2,5	95
2	5–6	43–45	5–6	40–45
3	7	35	7	35
4	8	30	8	25–30
5	10–11	24–25	-	-
6	13–14	15–16

При этом максимальное значение отношения цитохром С/ТМФД-оксидазных активностей составляло 8,0 ед.,минимальное-2,5 единицы. Уровень его в 2,5–3,0ед. имел место у плановых больных, поступивших для оперативного лечения хронического не осложнённого холецистита, язвенной болезни 12п/к. Высокий уровень коэффициента имел место у пациентов с гепатолиенальным синдромом, циррозом печени, внутрипечёночной формой портальной гипертензии, механической желтухой.

Данные этой таблицы также свидетельствуют о том, что и в эксперименте у лабораторных животных, и в клинике у больных нами получены практически идентичные значения процента жизнеспособной паренхимы и соответствующих ей значения коэффициента. Это позволяет предположить, что в животных клетках отношение цитохромС к ТМФД-оксидазной активности является постоянной величиной, которая по-видимому, изменяется однотипно и в основе изменения лежат одни и те же биохимические процессы.

Выводы:

1. Повреждения печени при затравке гепатотропными ядами и обтурационной желтухе приводит к ингибированию цитохромоксидазы.
2. Соотношение цитохромС/ТМФД-оксидазных активностей является показателем деструкции внутренней митохондриальной мембраны и нарушения биоэнергетики гепатоцитов.
3. Уровню коэффициента соответствует определённое количество повреждённой /или сохранной/ паренхимы печени.
4. В эксперименте у животных и в клинике при заболеваниях органов гепато-биллиарной зоны получена тождественность результатов уровня коэффициента и процента сохранной паренхимы печени.
5. Использование коэффициента позволяет прогнозировать исход заболевания, объективно подходить к выбору метода оперативного и консервативного лечения, следить за течением послеоперационного периода.

Литература:

1. Дунаевский О. А. Дифференциальная диагностика заболеваний печени.-М., Медицина 1985. -262с.
2. Подымова С. Д. Болезни печени: Рук. Для врачей. — М. Медицина, 1998. — 704 с.
3. Масевич Ц. Т., Ермолаева Л. Г. Клинические, биохимические, морфологические особенности хронических гепатитов различной этиологии // Терапевтический архив. — 2002.-№ 2.-С.35–37.
4. Наврузбеков М. С. Оценка функциональных резервов печени и методы прогнозирования печёночной недостаточности при операциях на печени // Автореферат диссертации на соискание кандидата медицинских наук. М.,2009.-34 с.
5. Сахипов С. Ж. Нарушение функционального состояния и микроциркуляции печени при механической желтухе. Дисс.к.м.н.- М.,1983.-162 с.
6. Титов В. Н. Биохимические методы диагностики патологии печени.//Терапевтический архив.- 1993,-№ 2.-С. 85–89.
7. Хазанов А. И. Функциональная диагностика болезней печени.,- М., Медицина, 1988.- 302 с.
8. Ozawa Kazue/ Adaptive response of the liver mitochondrial and its relation to hepatic functional reserve. Evalution by cytochrome a (+ a 3) assay and glucosae intolerance “Asian Med J”, 1980,23 № 7, P.499–528.
9. Болезни печени и желчевыводящих путей: Руководство для врачей / Под ред. В. Т. Ивашкина. М. ООО «Издат. дом «МВести», 2002. с. 416.
10. Physiology of the G astrointestinal tract. New York, Raven Press, 1994. p. 1556–1865.
11. Johnson L. R. (ed) Gastrointestinal Physiology, 5th ed. New York: Plenum Press, 1996. p. 720.
12. Kuntz E., Kuntz HD. Hepatology, Principles and practice: history, morphology, biochemistry, diagnostics, clinic, therapy. Berlin Heidelberg New York Springer Verlag, 2000. p. 825.