Кто боится комаров



Проведено комплексное исследование зависимости индивидуальной чувствительности (уровень болезненности и эмоциональное отношение) к укусам комаров от генетических маркеров, связанных с воспалением. Было показано, что носители определённых аллелей генов комплекса гистосовместимости человека HLA имеют более выраженную кожную реакцию на укусы комаров, тогда как эмоциональный аспект индивидуальной чувствительности, по-видимому, зависит от предыдущего опыта. «Боялись» те, кому было «больно» (имели болезненный опыт предыдущих встреч с комарами), и аллергики, которые тревожатся за свое здоровье. Полученные данные находятся в соответствии с данными мировой научной литературы и вносят вклад в представления о взаимоотношении человека с окружающей средой.

Ключевые слова: укусы комаров, генетические маркеры.

Моя мама боится комаров, а мы с папой — нет. Настоящие комары (или кровососущие комары Culicidae) — это семейство двукрылых насекомых, для которых характерны особые ротовые органы: верхняя и нижняя губа вытянуты и образуют футляр, в котором помещаются тонкие иглы двух пар челюстей. Как правило, самцы и самки комаров питаются нектаром и соками растений. Однако у некоторых видов самка должна получить питательные вещества из крови жертвы, прежде чем она сможет производить яйца, а у других видов после питания кровью самки приобретают способность производить больше яиц. Челюстями комар прорезает дырочку в коже, погружает хоботок до уровня кровеносных капилляров и по этим же ротовым придаткам, как по трубочке сосёт кровь [4]. Большой ущерб здоровью человека комары наносят, как переносчики инфекционных и паразитарных заболеваний. Однако есть и другие проблемы взаимоотношений человека с кровососущими комарами. Сам по себе укус комара неощутим, так как глубина введения хоботка составляет только 0,05 мм. Однако при проколе комар вводит в ранку слюну, препятствующую свертыванию крови, что вызывает местную аллергическую реакцию [9]. Разные люди неодинаково реагируют на укусы комаров, иногда реакция бывает очень сильной.

Почему же люди по-разному реагируют на одно и то же воздействие? Давайте рассмотрим этот вопрос с позиций генетики. Мы знаем, что информация о человеке закодирована в последовательности ДНК, которая у разных людей совпадает на 99,9 % [3]. Так чем же мы отличаемся друг от друга? Даже замена одного нуклеотида в определенном месте может изменить свойства белка, который кодирует этот ген. А у нас в геноме, по данным разных исследователей, насчитывается до 10 миллионов таких одно-нуклеотидных замен, или SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Их изучают как генетические маркеры наследственности и предрасположенности к различным заболеваниям. Они передаются от родителей детям. Разнообразие последовательностей ДНК у людей объясняет, почему у них по-разному происходит течение различных заболеваний, реакции в ответ на инфекции, прием лекарств, вакцин и т. п. Огромное значение SNP в биомедицинских исследованиях состоит в том, что их используют для сравнения участков генома между исследуемыми группами (например, одна группа — люди с определенным заболеванием, а вторая — без него) [6].

Больше всего SNP находится в области генов комплекса гистосовместимости человека HLA (Human Leukocyte Antigens), который отвечает за распознавание иммунной системой «своего» и «чужого». Этот локус расположен на 6-й хромосоме и содержит большое количество генов, связанных с иммунной системой человека. Некоторые SNP могут быть маркерами таких нарушений иммунитета, как воспалительная гипериммунная реакция [8], а мы все испытали на себе, что укус комара может проявляться болезненной кожной реакцией. «Боязнь», в свою очередь, может быть обусловлена как предыдущим (болезненным) опытом общения с комарами, так и другими факторами, например, особенностями характера человека, или иметь собственную генетическую основу.

Целью нашего исследования было определить зависимость индивидуальной чувствительности (уровень болезненности и эмоциональное отношение) к укусам комаров от генетических маркеров HLA, связанных с воспалением.

Материалы и методы

Подбор группы для исследования. Всего было исследовано 27 человек. Это: 2 семьи — 17 генетических родственников; контрольную группу составили — 3 не генетических родственника и 7 — не родственников. До начала исследования было известно, что мать пробанда имеет генетические маркеры HLA-B8, HLA-DR3 (упрощенное обозначение аллеля HLA-DRB1*03) и TNF-308A , отец — TNF-308A.

Разработка анкеты-опросника. Воснову создания анкеты-опросника были положены следующие принципы:

1) анкета должна содержать вопросы об общем состоянии иммунной системы, о физической (уровень болезненности) и эмоциональной составляющей реакции на укусы комаров;

2) принципиально важные вопросы, по возможности, должны повторяться в измененной форме;

3) анкета должна быть компактной.

Получение буккальных клеток и выделение ДНК. Материалом для исследования служили буккальные клетки, которые получали соскабливанием ватной палочкой с внутренней поверхности щеки [14]. Ватную палочку помещали на индивидуальные бумажные носовые платки и высушивали на воздухе не менее 3 часов, после чего упаковывали в те же бумажные носовые платки и чистые полиэтиленовые пакеты. Выделение ДНК проводили по методу Saab Y. B. [14]. В 1,5 мл пробирки помещали ватную палочку с буккальным соскобом и отрезали палочку под крышку. В пробирки добавляли по 300 мкл раствора 50мМ NaOH, затем встряхивали 10 сек. После этого пробирки помещали в нагретый до 95 ^о С термостат на 5 минут. Затем пинцетом извлекали ватные палочки, а к оставшемуся в пробирке раствору добавляли 30 мкл 1М Tris-HCl pH=8,0. Раствор встряхивали 10 секунд, после чего центрифугировали в течение 5 минут при 13 тыс.об./мин. Осветленный раствор (супернатант), в котором содержалась ДНК, переносили в новую пробирку и использовали для анализа.

Определение SNP методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Генетические маркеры HLA-A1, HLA-B8, HLA-DR3 и TNF-308A определяли методом ПЦР как описано ранее Маливановой Т. Ф. с соавторами [5]. К 18 мкл реакционной смеси добавляли 2 мкл препарата ДНК. Реакция проходила в приборе-амплификаторе Терцик (ДНК-технология, Россия). Чтобы увидеть ПЦР-продукты, их вносили в лунки 2 % агарозного геля с добавлением этидиума бромида, который светится под действием ультрафиолетового (УФ) излучения. Под действием электрического поля фрагменты ДНК (ПЦР-продукты) движутся в агарозном геле и разделяются по размеру. На Рисунке 1 представлены примеры реакции. 1-е треки — 100 п.о. маркер длины; ПЦР-продукты TNF-308 и HLA-DR3 — в районе 200 п.о., ПЦР-продукты HLA-A1 и HLA-B8 — в районе 600 п.о. Для контроля реакции использовали ДНК с известным генотипом (на рисунке указано стрелкой).

Основные принципы составления генеалогического древа. При составлении генеалогического древа:

1) представителей одного поколения обозначали в горизонтальном ряду, разных поколений — по вертикали от старших (вверху) к младшим (внизу);

2) мужчин обозначали квадратом, женщин кругом;

3) квадраты и круги разделяли по четвертям, которые закрашивали в соответствии с наличием четырех исследованных генетических маркеров.

Статистическая обработка полученных данных. При анализе полученных данных группы сравнения формировали по бинарному принципу (генетические родственники/не генетические родственники; мужчины/женщины; «аллергия» да/нет; «боюсь» да/нет; «больно» да/не очень+нет или да+не очень/нет; генетические маркеры ( HLA-A1, HLA-B8, HLA-DR3 и TNF-308A ) да/нет). Экспериментальные данные заносили в четырехпольные таблицы (2х2) on-line калькулятора статистического критерия Фишера [1]. При уровне значимости p<0,05 различия между группами считали статистически достоверными.

Рис. 1. ПЦР-продукты в 2 % агарозном геле

Результаты исследования

Составление и анализ анкеты-опросника

Чтобы определить индивидуальную чувствительность к укусам комаров, нами была разработана анкета (Таблица 1). Заполнение анкеты проводилось испытуемыми самостоятельно одновременно с получением соскоба буккального эпителия ватными палочками. При обработке данных вопросы № № 1, 9, 12 оказались неинформативными. Наиболее информативными были два блока вопросов — это вопросы о кожной реакции (3 вопроса — № № 6, 7, 8 в Таблице 1) и об эмоциональном отношении к комарам (5 вопросов — № № 3, 4, 5, 10, 11 в Таблице 1). Результат анкеты в каждом блоке оценивался по большинству положительных или отрицательных ответов (2 из 3 для блока вопросов о кожной реакции и 3 из 5 для блока вопросов об эмоциональном отношении) и в дальнейшем использовались в анализе как категории «Больно» и «Боюсь», соответственно. Для анализа также использовали ответы на вопрос «Есть ли у Вас аллергии?» (без уточнения на что аллергия, т. е. в том числе не связанные с насекомыми).

Таблица 1

Анкета-опросник

48 % опрошенных ответили, что имеют аллергии, 37 % «боялись» комаров, 18 % было действительно «больно», по 41 % — «не очень больно» и «не больно».

Интересно, что женщины в 3 раза чаще, чем мужчины «боялись» (Рисунок 2А), и им было «больно» (Рисунок 2Б). Однако, поскольку соотношение мужчин и женщин, как среди генетических родственников, так и в контрольной группе было примерно одинаково (Рисунок 2В), в дальнейшем в общей группе пол не учитывали.

Рис. 2. Результаты анкетирования среди мужчин и женщин (А –вопросы об эмоциональном отношении к комарам, Б — о кожной реакции). В — соотношение мужчин и женщин среди генетических родственников и в контрольной группе

Результаты генотипирования по маркерам HLA - A 1, HLA - B 8, HLA - DR 3 и TNF -308 A .

ДНК была выделена из 27 образцов буккального эпителия (17 от генетических родственников, 3 от не генетических родственников и 7 от не родственников) и проведен генетический анализ.

Три из четырех исследованных генетических маркеров, связанных с воспалением, чаще встречались среди генетических родственников, чем в контрольной группе ( TNF-308A — 76 % и 25 %, соответственно, р=0,0069 ; HLA-A1– 6 % и 20 %; HLA-B8– 24 % и 10 %; HLA-DR3– 47 % и 20 %) (Рисунок 3).

Рис. 3. Частота встречаемости генетических маркеров у генетических родственников и в контрольной группе (не (генетические) родственники). * — различие статистически достоверно, p<0,05

Составление генеалогического древа

На основе полученных данных было построено генеалогическое древо с указанием генотипов (Рисунок 4). В составленном генеалогическом древе отражена передача исследованных генетических маркеров в трех поколениях. Было исследовано 2 семьи относительно пробанда (f21): 8 генетических родственников и 1 не генетический родственник (f6) — со стороны матери; 8 генетических родственников и 2 не генетических родственника (f14 и f17) — со стороны отца. Оказалось, что больше всего генетических маркеров в семье матери — большинство генетических родственников имеют 2 или 3 маркера ( HLA-B8, HLA-DR3 и TNF-308A ). В семье отца передается только 1 маркер ( TNF-308A ) . В контрольной группе у большинства (у 4 из 6) таких генетических маркеров нет.

Рис. 4. Генеалогическое древо с указанием генетических маркеров (справа не родственники из контрольной группы f22-f27).

Интересно, что генетические маркеры могут и «исчезать», как это схематично показано на примере одного из исследованных (Рисунок 5).

Рис. 5. Схема наследования для f21 (генетические маркеры «исчезают»)

Зависимость индивидуальной чувствительности к укусам комаров от генетических маркеров.

Была проанализирована зависимость субъективных параметров («Боюсь» и «Больно») и генетических маркеров. В анализ также было включено наличие аллергии (на любые аллергены).

На Рисунке 6 представлено сравнение 2 групп: кто «боится» комаров и кто «не боится». Оказалось, что среди тех, кто «боится», по сравнению с теми, кто «не боится», достоверно больше аллергиков (80 % и 29 %, соответственно; р=0,018 ) и тех, кому действительно «больно» (40 % и 6 % среди тех р=0,047 ). Статистически достоверной зависимости боязни от генетических маркеров в нашем исследовании обнаружено не было. В то же время, кожная реакция, которая описывалась блоком вопросов «Больно», зависела от генетических маркеров (Рисунок 7), причем, маркер HLA-B8 достоверно чаще встречался у тех, кому было действительно «больно» (60 %, по сравнению с 9 % среди остальных р=0,029 ), тогда как HLA-DR3 чаще выявлялся среди тех, кому было «больно» и «не очень больно» (56 %, по сравнению с 9 % среди тех, кому «не больно» р=0,018 ). Таким образом, боятся те, кому больно, а больно тем, у кого есть эти генетические маркеры.

Рис. 6. Сравнение частот встречаемости субъективных параметров и генетических маркеров в 2-х группах: кто «боится» комаров и кто «не боится». * — различие статистически достоверно, p<0,05.

Рис. 7. Сравнение частот встречаемости субъективных параметров и генетических маркеров в 3-х группах: кому действительно «больно», «не очень больно» и «НЕ больно». * — различие статистически достоверно, p<0,05.

Обсуждение

Комар обыкновенный, или пискун (семейство Culicidae, род Culex pipiens) — это политипический вид (состоящий из многих подвидов) кровососущих комаров, широко распространенный на территории Российской Федерации. Кровью питается только самка, так как это необходимо для развития яиц. Сам по себе укус комара (не принимая во внимание переносимые им инфекции) может вызывать ответную реакцию — кулицидоз. У разных людей она может выражаться как легким или более тяжелым местным воспалением (поражённое место краснеет, появляется сильный зуд, волдырь, отек мягких тканей), так и иметь системный характер (со значительным повышением температуры тела, тошнотой и рвотой, падением артериального давления, головными болями и головокружением, вплоть до потери сознания) [7].

Признаки кулицидоза совпадают с признаками местного воспаления по Цельсу (древнеримский учёный, ок. 30 г до н. э.): Calor — жар, Rubor — краснота, Tumor — опухоль, Dolor — боль [2]. По современным представлениям работа иммунной системы сводится к балансу воспалительных и противовоспалительных факторов. Слюна комара оказывает обезболивающее действие, угнетая некоторые воспалительные факторы и смещая равновесие в сторону противовоспалительных реакций [10]. Тесные взаимоотношения комаров с человеком эволюционно привели к процессу получения необходимого питания (крови) с минимальным причинением беспокойства для жертвы. И это относится к большинству людей, тогда как люди с редкими генетическими маркерами воспалительного плеча иммунной системы, как показывает наше исследование, чувствительны к укусам комаров. Таким образом, наше исследование является аргументом в пользу того, что отбор обезболивающих веществ слюны комара был направлен на всю популяцию человека, на усреднённую реакцию, на блокирование функции часто встречающихся аллелей. При этом для носителей редких аллелей концентрация обезболивающих веществ, по-видимому, не оптимальна и вызывает нестандартную болезненную реакцию.

Известно, что исследованные генетические маркеры связаны с повышенной продукцией воспалительных факторов (что определило их выбор в нашей работе) и встречаются в популяции относительно редко. Так, частота встречаемости в российской популяции TNF-308A — 23 %, HLA-A1– 22 %, HLA-B8– 13 %, HLA-DR3– 18 % [5]. Очень близкие значения были получены и для нашей контрольной группы (Рисунок 3). При этом у генетических родственников маркеры, по результатам нашей работы определяющие болезненность укуса HLA-B8 и HLA-DR3 , встречались в 2 раза чаще. Следует отметить, что при подборе группы для исследования предполагалось, что частота встречаемости выбранных маркеров должна быть достаточно высокой для проведения статистического анализа, т. к. заранее было известно, что отец и мать пробанда имеют эти генетические маркеры. Таким образом, в этой части работы мы получили ожидаемый результат.

Примечательно, что пример наследования для пробанда f21 (Рисунок 5) полностью иллюстрирует идею о зависимости индивидуальной чувствительности к укусам комаров от генетических маркеров т. к. действительно, по результатам анкетирования пробанд f21, как и его отец f13 (на Рисунке 5) — «не боятся» укусов комаров, тогда как мать f4 — «боится». Таким образом, мы ответили на изначально поставленный вопрос — почему «Моя мама боится комаров, а мы с папой — нет». Очевидно, что изучение этого вопроса должно было быть комплексным, что отражено в разработанной нами анкете-опроснике. В анкету были включены вопросы о кожной реакции (относительно объективные данные, вопросы № № 6, 7, 8 в Таблице 1) и об эмоциональном (очень субъективном) отношении к комарам, которое может быть сформировано в результате предыдущих встреч с кровососущими насекомыми, особенностей эмоционального восприятия, навязанного чужого мнения и т. д. Действительно, в результате анализа полученных данных мы смогли сделать комплексное двухэтапное заключение: «боятся» те, кому «больно», а «больно» тем, у кого есть генетические маркеры HLA-B8 и HLA-DR3 .

Группа английских учёных из Кембриджа провела масштабное сравнение геномов людей с разным уровнем реакции на укусы комаров (размер покраснения и вздутия, интенсивность зуда, «привлекательность» человека для насекомого). Использованный метод (genome-wide association studies, GWAS) позволил выявить протяженные области, содержащие гены иммунной системы, отвечающие за реакцию на укусы комаров [12]. Примечательно, что несколько таких областей находились в системе генов HLA в непосредственной близости от исследованных нами маркеров. В своем исследовании мы, в какой-то мере, продвинулись дальше и определили отвечающие аллели двух генов. Таким образом, наши данные являются приоритетными и находятся в соответствии с данными мировой научной литературой. Нужно отметить, что по данным Jones A. V. с соавторами [12] одна из выявленных областей отвечала за трехкратное увеличение интенсивности зуда от укусов комаров у женщин, по сравнению с мужчинами. Аналогично, наши данные показывают, что женщины в 3 раза чаще, чем мужчины «боялись» и им было «больно» (Рисунок 2), хотя эти данные статистически незначимы. К сожалению, более подробный анализ мы не смогли провести из-за небольшого объема нашей выборки, что, конечно, является недостатком этой работы и требует дальнейших исследований.

Таким образом, болезненные ощущения при укусах комаров не являются плодом воображения, а имеют реальную генетическую основу. В наше исследование не были включены люди, которым когда-либо требовалась серьезная медицинская помощь из-за укусов комаров, но повышенную чувствительность, которую мы можем наблюдать у других людей или испытывать сами (главным образом сильный зуд, возможно небольшой озноб и незначительное повышение температуры), можно причислить к снижению качества жизни. А современная медицина считает снижение качества жизни вполне медицинской проблемой и ищет способы коррекции таких состояний. Однако есть и действительно тяжелые формы этого заболевания . В 2016 году ВОЗ (Всемирная Организация Здравоохранения) впервые ввела в классификацию заболеваний «гиперчувствительность к укусам комаров» (Hypersensitivity to mosquito bites, HMB) как кожную форму хронической активной инфекции вируса Эпштейна-Барра (EpsteineBarr virus, EBV). Это заболевание активно изучается в странах Азиатско-Тихоокеанского региона (Корея, Тайвань, Япония, страны Латинской Америки). Гиперчувствительность к укусам комаров чаще бывает у детей и проявляется крайне тяжелыми кожными реакциями, сопровождающимися высокой температурой, большим содержанием лимфоцитов в крови, увеличением лимфатических узлов, повреждением печени [13]. Ученые выяснили, что при гиперчувствительности к укусам комаров реакция иммунной системы отличается от обычной аллергической реакции. Слюна комара в месте укуса привлекает и активирует лимфоциты, содержащие вирус Эпштейна-Барра и в дальнейшем это может приводить к лимопролиферативным заболеваниям. Таким образом, гиперчувствительность к укусам комара может быть первым клиническим проявлением инфекции EBV [11].

Заключение

Было проведено комплексное исследование, в результате которого мы выяснили, что, во-первых, генетические маркеры, связанные с воспалительным плечом иммунной системы, вызывают повышенную кожную реакцию на укусы комаров, во-вторых, эмоциональный аспект индивидуальной чувствительности, по-видимому, зависит от предыдущего опыта. «Боялись» те, кому было «больно» (имели болезненный опыт предыдущих встреч с комарами), и аллергики, которые тревожатся за свое здоровье (знают о возможности реакции на различные аллергены). Полученные данные находятся в соответствии с данными мировой научной литературы и вносят вклад в фундаментальные представления о взаимоотношении человека с окружающей средой, а также могут быть основой для дальнейших прикладных медико-биологических исследований.

Литература:

1. Анализ четырехпольных таблиц сопряженности (сравнение процентных долей в двух группах) (онлайн калькулятор) [Электронный ресурс] // Медицинская статистика. — URL: https://medstatistic.ru/calculators/calchi.html (дата обращения 16.02.2021)
2. Воспаление. Материал из Википедии [Электронный ресурс] // Википедия — свободная энциклопедия. — URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/Воспаление (дата обращения 16.02.2021)
3. Животовский Л. Мы не только различны, но и удивительно схожи / Л. Животовский // Наука и жизнь. — 2006. — № 4. URL: https://www.nkj.ru/archive/articles/5289/ (дата обращения 16.02.2021)
4. Кровососущие комары. Материал из Википедии [Электронный ресурс] // Википедия — свободная энциклопедия. — URL: — https://ru.wikipedia.org/wiki/Комары (дата обращения 16.02.2021)
5. Маливанова Т. Ф. Общая выживаемость больных раком молочной железы зависит от сочетания полиморфизмов гена фактора некроза опухоли и HLA-гаплотипов / Т. Ф. Маливанова, Е. В. Алферова, А. С. Осташкин, Т. А. Астрелина, Н. Н. Мазуренко // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология — 2020. — Т.38. — № 1. — С.41–9. DOI: https://doi.org/10.17116/molgen20203801140
6. Однонуклеотидный полиморфизм. Материал из Википедии [Электронный ресурс] // Википедия — свободная энциклопедия. — URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/Однонуклеотидный_полиморфизм (дата обращения 16.02.2021)
7. Укус комара. Симптомы, лечение и способы защиты от комаров [Электронный ресурс] // СЭС контроль. — URL: https://ses-control.ru/articles/ukus-komara.html (дата обращения 16.02.2021)
8. Человеческий лейкоцитарный антиген. Материал из Википедии [Электронный ресурс] // Википедия — свободная энциклопедия. — URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/человеческий_лейкоцитарный_антиген (дата обращения 16.02.2021)
9. Ясюкевич В. В. Кровососущие комары как переносчики климатозависимых заболеваний / В. В. Ясюкевич // Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. — 2009. — Т.22. — С.170–197. URL: https://www.elibrary.ru/item.asp?id=26001189 (дата обращения 16.02.2021)
10. Briant L. Role of skin immune cells on the host susceptibility to mosquito-borne viruses / L. Briant, Ph. Desprès, V. Choumet, Missé D. // Virology — 2014. — V. 464–465. — P. 26–32. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.virol.2014.06.023
11. Chiu T.-M. Hypersensitivity to mosquito bites as the primary clinical manifestation of an EpsteineBarr virus infection / T.-M. Chiu, Y.-M. Lin, S.-C. Wang, Y.-G. Tsai // Journal of Microbiology, Immunology and Infection — 2016. — V. 49. — P. 613–16. DOI: http://dx.doi.org/ 10.1016/j.jmii.2014.01.008
12. Jones A. V. GWAS of self-reported mosquito bite size, itch intensity and attractiveness to mosquitoes implicates immune-related predisposition loci / A. V. Jones, M. Tilley, A. Gutteridge, et all. // Human Molecular Genetics. — 2017. — V. 26. — Issue 7. — P. 1391–1406. DOI: https://doi.org/10.1093/hmg/ddx036
13. Montes-Mojarro I. A. Epstein — Barr virus positive T and NK-cell lymphoproliferations: Morphological features and differential diagnosis / I. A. Montes-Mojarro, W. Y. Kim, F. Fend, L. Quintanilla-Martinez // Seminars in Diagnostic Pathology. — 2020. — V. 37. — P. 32–46 DOI: https://doi.org/10.1053/j.semdp.2019.12.004
14. Saab Y. B. Buccal Cell DNA Extraction: Yield, Purity, and Cost: A Comparison of Two Methods / Y. B. Saab, W. Kabbara, Ch. Chbib, P. R. Gard // GENETIC TESTING. — 2007. — V. 11. — N. 4. — P. 413–16. DOI: https://doi.org/10.1089/gte.2007.0044