Введение

Актуальность исследований в области селекции сельскохозяйственных культур обусловлена необходимостью создания сортов, устойчивых к изменяющимся климатическим условиям. Озимый рапс (Brassica napus L.) является стратегическим объектом селекции благодаря своим биологическим особенностям и высокой значимости для агропромышленного комплекса. Однако продуктивность культуры в значительной степени лимитируется абиотическими факторами на ранних этапах развития. Осмотический стресс (вызванный засолением или физиологической засухой) и гипоксический стресс (избыточное увлажнение) являются основными факторами, лимитирующими прорастание семян в полевых условиях [1], [2].

Мы предположили, что разработанный комплексный лабораторный подход (моделирование осмотического стресса различной интенсивности и гипоксии с последующей оценкой морфофизиологических показателей) позволит выявить статистически значимые различия в реакции различных генотипов озимого рапса на стрессовые условия и объективно ранжировать их по степени устойчивости, определив пороговые значения стресс-факторов, критические для прорастания.

Целью данной работы является изучение реакции семян различных генотипов рапса на моделируемые стрессы.

Методологический фундамент

В качестве методологического фундамента использован комплексный подход, позволяющий оценить реакцию семян на осмотическое давление и дефицит кислорода, что крайне важно для понимания адаптивного потенциала сортов в условиях реального производства [3].

Для определения генетически обусловленной силы роста осевых органов использовался метод рулонов. Семена закладывались в увлажненную фильтровальную бумагу, которая сворачивалась в вертикальные рулоны. Метод позволяет получить объективные морфометрические параметры (длину главного корня и гипокотиля) без механического сопротивления субстрата.

Осмотический стресс моделировался с использованием растворов сульфата натрия (Na ₂ SO ₄ ) в градиенте концентраций: 1 %, 2 %, 3,6 % и 5 %.

Гипоксический стресс создавался методом «глубокой воды» с погружением семян под слой 0,5 см и 1,0 см.

Для глубокого понимания механизмов устойчивости проводился анализ накопления биомассы. Взвешивание сырой и сухой массы проростков выполнялось на аналитических весах [4], [5], [6].

Подготовка к эксперименту

Объектами исследования послужили пять сортов озимого рапса: «Сэмми», «Норд», «Северянин», «777 Китай» и «229 дн Китай». Все семена соответствовали требованиям ГОСТ по чистоте и не имели видимых механических повреждений.

Для создания градиента осмотического стресса использовался раствор сульфата натрия (Na₂SO₄, химически чистый) различной концентрации. Дистиллированная вода служила контролем (0 % раствор).

Выбор сульфата натрия в качестве осмотика был обоснован его меньшей токсичностью для растений по сравнению с хлоридами, что позволяло в большей степени моделировать именно осмотический, а не ионный специфический стресс. Градация концентраций от 1 % до 5 % позволяла выявить как пороговый эффект, так и уровень толерантности каждого сорта.

Для обеспечения репрезентативности данных и статистической достоверности результатов эксперимент был заложен в двукратной аналитической повторности для каждого варианта.

Оценка влияния осмотического стресса

Наблюдения за прорастанием семян, ростом корней и гипокотилей проводились трижды через фиксированные промежутки времени. Даты наблюдений были выбраны исходя из динамики процесса: первое измерение — на этапе начала массового прорастания, последующие — на этапах активного роста.

Порядок проведения измерений:

1. Подсчет проросших и непроросших семян

В каждой чашке Петри визуально фиксировалось количество семян, у которых корешок достиг длины, превышающей размер семени (в соответствии с ГОСТ 12038–84), и количество семян без видимых признаков прорастания или с явными аномалиями.

2. Морфометрический анализ проростков

Для каждой чашки Петри случайным образом отбиралось 3 типичных нормально развитых проростков (при их наличии). Для каждого из них с

помощью линейки с точностью до 1 мм измерялась (Рисунок 3):

— Длина главного корня (Lкорня, мм);

— Длина гипокотиля (ростка) (Lростка, мм) — от корневой шейки до точки прикрепления семядольных листьев.

1. Расчет индексов устойчивости к осмотическому стрессу

Для объективной оценки и сравнения реакции сортов на осмотический стресс по данным, полученным в последнее (итоговое) измерение, были рассчитаны относительные индексы (Таблица 1):

— Индекс всхожести (ИВ, %) показывает, какой процент от своей потенциальной всхожести сохраняет сорт в стрессовых условиях (Рисунок 1).

— Индекс длины корня (ИДК, %): характеризует способность сорта поддерживать рост наиболее чувствительной к стрессу корневой системы (Рисунок 2).

— Индекс длины ростка (ИДР, %): отражает влияние стресса на рост надземной части проростка (Рисунок 3).

— Ранжирование сортов по комплексной устойчивости: для каждого сорта и каждой концентрации был рассчитан суммарный балл устойчивости (СБУ). Поскольку разные признаки могли иметь разную значимость для выживания проростка, в данной работе им был присвоен равный вес.

СБУ = ИВ + ИДК + ИДР

Таблица 1

Индексы устойчивости при осмотическом стрессе

Рис. 1. Динамика всхожести в стрессовых условиях

Рис. 2. Динамика длины корня в стрессовых условиях

Рис. 3. Динамика длины ростка в стрессовых условиях

Чем выше суммарный балл СБУ, тем более устойчивым считался сорт на данном уровне осмотического стресса. На основе СБУ было проведено ранжирование сортов озимого рапса (рисунок 4).

Рис. 4. Ранжирование сортов рапса на основе рассчитанного СБУ

На основе первичных наблюдений можно было ожидать, что сорта «Норд», «Сэмми» и «Северянин» покажут более высокие индексы устойчивости по сравнению с китайскими сортами «777» и «229 дн», особенно при концентрации 2 %.

Метод проращивания в рулонах

Данный метод должен был дать уникальную информацию о силе начального роста, особенно корневой системы, в оптимальных условиях.

Наблюдения за прорастанием семян, ростом корней и гипокотилей проводились трижды через фиксированные промежутки времени. Даты наблюдений были выбраны исходя из динамики процесса: первое измерение — на этапе начала массового прорастания, последующие — на этапах активного роста.

Рулоны аккуратно разворачивали, не отрывая проростки от бумаги (рисунок 5).

Рис. 5. Проращивание семян озимого рапса в рулонах

С помощью предварительно нанесенной разметки (сетка с шагом 1 см) все проростки в каждом рулоне распределяли по классам в зависимости от длины их корня и ростка.

Для каждого сорта и каждой повторности (рулона) подсчитывалось количество проростков, попавших в каждый класс на каждую дату наблюдения. Это позволило отследить не только среднюю длину, но и однородность и скорость роста популяции семян.

При данном методе рассчитывались абсолютные показатели силы роста и энергии прорастания, которые затем сопоставлялись с реакцией этих же сортов на стресс.

На основе данных итогового (третьего) измерения рассчитывались:

— Средневзвешенная длина ростка (Lср.взв.р, см):

— Средневзвешенная длина корня (Lср.взв.к, см):

Результаты расчета показателя представлены в таблице 2, таблице 3 и на рис. 6.

Таблица 2

Средневзвешенные значения длины корней

Таблица 3

Средневзвешенные значения длины ростков

Рис. 6. Распределение проростков по длине корня

— Процент проростков с длиной корня> 4 см (П>4см, %)

Показатель является индикатором энергии прорастания и силы начального роста. Семена, способные за стандартный срок развить корневую систему длиннее 4 см, обладают высоким запасом жизненных сил и метаболической активностью.

Результаты расчета показателя представлены в таблице 4.

Таблица 4

Количество проростков с длиной корня > 4 см

В отсутствие стресса сорта статистически значимо различались по силе начального роста корневой системы. Наибольшей средневзвешенной длиной корня (9,44 см) и максимальным процентом проростков с корнем длиннее 4 см (97,56 %) характеризовался сорт «Норд», что указывало на его высокий потенциал к укоренению. Сорта «Северянин» и «Сэмми» показали схожие высокие результаты, в то время как сорта китайской селекции «777 Китай» и особенно «229 дн Китай» (7,13 см) уступили лидерам.

Полученные данные позволили выдвинуть рабочую гипотезу о том, что сорт с наиболее мощной корневой системой в контроле мог проявить и более высокую толерантность к абиотическим стрессам, что было проверено в последующих экспериментах.

Оценка влияния осмотического стресса на водный статус и накопление биомассы

Данный этап работы был направлен на оценку физиологических последствий осмотического стресса, которые не всегда очевидны при визуальном наблюдении, — изменения гидратации тканей и истинного роста (накопления сухого вещества).

Порядок проведения:

1. Отбор образцов

После проведения итоговых измерений длины из опытных чашек Петри (для контроля, 1 % и 2 % растворов Na₂SO₄) и из рулонов (оптимальные условия) для каждого сорта были отобраны проростки. Общий объем выборки составил 20 проростков на вариант опыта (сорт × концентрация).

2. Подготовка к взвешиванию

У каждого проростка аккуратно отделяли корневую систему от гипокотиля (надземной части). Корни и гипокотили каждого сорта и для каждого варианта опыта объединяли в две отдельные группы.

3. Взвешивание сырой биомассы

Предварительно взвешивались пустые бюксы. Затем в бюксы помещались группы корней или гипокотилей и взвешивались снова. Взвешивание проводилось на аналитических весах с точностью 0,01 г. Разница между массой бюкса с образцом и массой пустого бюкса давала сырую биомассу (г).

4. Высушивание и взвешивание сухой биомассы

Бюксы с растительным материалом помещались в сушильный шкаф и выдерживались при температуре 105°C в течение 3 часов для полного удаления влаги. После этого бюксы повторно взвешивались для определения сухой биомассы (г).

5. Фиксация данных

Для каждого образца рассчитывались:

— Абсолютная потеря массы при сушке (г): Сырая масса — Сухая масса.

— Относительное содержание воды в тканях (%)

Содержание H₂O = (Абсолютная потеря массы / Сырая масса) * 100 %.

Этот показатель отражает гидратацию (тургор) тканей.

— Среднее значение сухой массы

Показатель метаболической активности и интенсивности роста.

Результаты расчетов приведены в таблице 5.

Таблица 5

Расчетные показатели биомассы ростков и корней

6. Расчет индексов и анализ данных по биомассе

Для сопоставления с данными по всхожести и морфометрии были рассчитаны интегральные индексы, отражающие способность сорта поддерживать гидратацию и рост биомассы в стрессовых условиях [7].

— Индекс сырой биомассы (ИСБ, %)

Показывал, насколько стресс угнетает общее накопление массы (вода + органическое вещество).

— Индекс сухой биомассы (ИСухБ, %)

Показатель отражал способность сорта к истинному росту (синтезу и накоплению органических веществ) в неблагоприятных условиях. Чем выше ИСухБ, тем эффективнее сорт преодолевал стресс на биохимическом уровне.

— Индекс потери воды (ИПВ, %)

Рассчитывался как отношение содержания воды в тканях при стрессе к контролю.

Значение ниже 100 % указывало на обезвоживание (осмотический дефицит), значение около или выше 100 % — на эффективную осморегуляцию.

Рассчитанные индексы представлены в таблице 6.

Таблица 6

Интегральные индексы биомассы корней и ростков

На основе рассчитанных индексов представлены изменения биомассы при осмотическом стрессе были построены диаграммы (рисунок 7, рисунок 8).

Рис. 7. Сырая и сухая биомасса корней в условиях осмотического стресса

Рис. 8. Сырая и сухая биомасса ростков в условиях осмотического стресса

Из диаграмм видно, что корневая система оказалась наиболее чувствительной к осмотическому стрессу: уже при 2 % Na₂SO₄ синтез сухого вещества в корнях (ИСухБ) падал на 40–75 % у всех сортов, что указывало на эту концентрацию как пороговую для корневого роста.

Надземная часть (ростки) обладала большим компенсаторным потенциалом: у устойчивых сортов («Норд», «Сэмми») в условиях стресса интенсифицировался биосинтез (ИСухБ >125 %), что являлось главным критерием физиологической толерантности.

Ранжирование сортов по устойчивости, основанное на комплексном анализе индексов (сохранение массы, биосинтез, гидратация), подтверждало, что сорт «Норд» являлся наиболее сбалансированным среди всех изучаемых сортов.

Метод глубокой воды для оценки устойчивости к гипоксическому стрессу

Данный метод применялся для моделирования условий острого дефицита кислорода (гипоксии), с которыми семена могут столкнуться в переувлажненной, затопленной почве или под ледяной коркой.

Порядок проведения:

1. Закладка опыта

Для каждого из 5 сортов были созданы три варианта:

— Контроль (0 см): семена на поверхности влажного субстрата (оптимальная аэрация).

— Слабая гипоксия (0,5 см): семена полностью были погружены под слой дистиллированной воды глубиной 0,5 см.

— Сильная гипоксия (1 см): семена были полностью погружены под слой воды глубиной 1 см.

2. Наблюдение и учет

Через установленный срок (2 суток) в каждой чашке Петри проводился подсчет семян, которые преодолели слой воды и сформировали нормальный проросток с корешком и гипокотилем. Учитывались только жизнеспособные проростки.

3. Расчет показателей

— Лабораторная всхожесть при гипоксии (%, G_hyp)

Рассчитывалась как средний процент проросших семян от общего их числа (100 шт) для каждого варианта глубины.

— Индекс устойчивости к гипоксии (ИУГ, %) показывал, какую долю от своей потенциальной всхожести (в контроле) сорт сохранял в условиях затопления.

— ИУГ ~100 %: сорт абсолютно устойчив к гипоксии на данной глубине.

— ИУГ <100 %: сорт чувствителен, чем ниже индекс, тем выше чувствительность.

— ИУГ ~ 0 %: сорт полностью не способен прорастать в данных условиях.

Рассчитанные индексы приведены в таблице 7.

Таблица 7

Расчетные индексы всхожести при гипоксическом стрессе

На основе рассчитанных индексов были построены диаграммы зависимости лабораторной всхожести и ИУГ от глубины погружения (Рисунок 9, Рисунок 10).

Рис. 9. Лабораторная всхожесть при гипоксическом стрессе

Рис. 10. Индекс устойчивости к гипоксии

Сорта «Сэмми», «Норд» и «Северянин» демонстрировали высокую устойчивость даже при погружении на 1 см. Их ИУГ (индекс устойчивости к гипоксии) оставался близким к 100 %, что говорило о практически полной сохранности всхожести в условиях гипоксии.

Сорта «777 Китай» и «229 дн Китай» проявляли высокую чувствительность к гипоксии: их всхожесть резко падала уже при погружении на 0,5 см.

Выводы

1. Разработанный комплексный лабораторный подход полностью подтвердил свою эффективность. Моделирование осмотического стресса (засоления Na₂SO₄) и гипоксии (затопления) выявило статистически значимые различия в реакции генотипов озимого рапса на оба типа стрессовых условий, что позволило объективно ранжировать сорта по степени устойчивости.

2. Были установлены четкие пороговые значения осмотического стресса, критические для прорастания. Концентрация Na₂SO₄ 3.6 % являлась критической для большинства сортов, приводя к полной потере всхожести. Исключение составил сорт «Сэмми», подтвердивший уникальную осмотическую устойчивость. Концентрация 2 % Na₂SO₄ служила дифференцирующим порогом, на котором статистически значимо проявлялись различия в устойчивости корневой и побеговой систем между сортами.

3. Были определены критические параметры гипоксического стресса. Погружение на глубину 0.5 см оказалось пороговым для чувствительных сортов китайской селекции («777 Китай» и «229 дн Китай»), в то время как устойчивые сорта («Сэмми», «Норд», «Северянин») сохраняли высокую всхожесть вплоть до глубины 1 см.

4. Морфофизиологические показатели (длина корня и ростка, водный статус, накопление биомассы) статистически значимо коррелировали с устойчивостью. Метод проращивания в рулонах показал, что начальная энергия роста корня является важным, но не единственным фактором устойчивости к гипоксии. Комплексная оценка через индексы всхожести (ИВ), длины корня (ИДК), длины ростка (ИДР) и суммарный балл устойчивости (СБУ) объективно выявила лидера — сорт «Сэмми».

5. Гипотеза полностью подтверждена.Подход позволил не только выявить и ранжировать сорта по комплексной устойчивости, но и определить конкретные пороговые значения стресс-факторов (3.6 % Na₂SO₄ и 0.5 см затопления), разделяющие устойчивые и чувствительные генотипы, что имеет практическое значение для семеноводства и подбора сортов под конкретные условия выращивания.

Комплексный лабораторный скрининг доказал свою прогностическую ценность для оценки устойчивости генотипов озимого рапса на ранних этапах онтогенеза, а выявленные пороговые значения стрессовых факторов могут быть использованы в качестве стандартизированных критериев в селекционных программах.

Литература:

1. В. М. Лукомец, С. В. Зеленцов, К. М. Кривошлыков, Перспективы и резервы расширения производства масличных культур в Российской Федерации // Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. — 2015. — № 4

2. Е. В. Соломонова, Е. Ю. Ембатурова, Ю. С. Черятова, С. Г. Монахос Масличность рапса: ботаническая природа, биохимические особенности и пищевой потенциал // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. — 2023

3. Proficiency Tests // ISTA Seed Quality Assutance URL: https://www.seedtest.org/en/proficiency-tests/standard-pt-results.html

4. ГОСТ 12038–84. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести. — М. Стандартинформ, 2011. — 32 с.

5. ГОСТ 12036–85. Семена сельскохозяйственных культур. Методы анализа. — М. Стандартинформ, 2011. — 13 с.

6. ГОСТ 12037–81. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения чистоты и отхода семян. — М. Стандартинформ, 2011. — 20 с.

7. В. И. Карпин, Н. И. Переправо, В. Н. Золотарев, В. Э. Рябова, Э. З. Шамсутдинова, Т. В. Козлова Методика определения силы роста семян кормовых культур. — М.: Издательство РГАУ — МСХА, 2012