ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) — своеобразный чертеж жизни, сложный код, в котором заключены данные о наследственной информации. Эта сложная макромолекула способна хранить и передавать наследственную генетическую информацию из поколения в поколение.

Цель: практическое выделение ДНК цельной крови по методу Мэтью в лаборатории наследственной патологии ФГБНУ «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем».

Задачи :

— Оценить преимущества и недостатки метода фенол-хлороформной экстракции ДНК.

— Изучить технику безопасности работы в генетической лаборатории.

— Изучить литературу и интернет-ресурсы по теме исследовательской работы.

— Освоить метод выделения ДНК из лимфоцитов периферической крови по методу Мэтью.

Объект исследования : Цельная кровь

Метод выделения : Фенол-хлороформная экстракция

Практическая част ь

Прежде чем начать работу, ознакомились с правилами техники безопасности, мой научный консультант контролировал и объяснял каждый шаг процесса экстракции ДНК.

Этап 1: Подготовка лимфоцитов

1. Поместить 1000 мкл цельной крови в 1,5 мл пробирку.
2. Добавить 400 мкл Реагента А .
3. Затем центрифугировать 5 мин при 6000 об/мин.
4. Аккуратно удалить верхнюю жидкую фазу (1–1,2 мл), стараясь не потревожить осадок. И так повторить первый этап 3 раза.

Этап 2: Лизис клеток

1. Добавить 400 мкл Реагента В и активно перемешивать в течении 5–10 мин на мульти-вортексе до полного растворения осадка.
2. Поместить в термоблок, нагретый до 65°С на 15–20 мин.

Этап 3: Разделение фаз

1. Добавить 100 мкл NaCl5

5 М раствор хлорида натрия (NaCl) является хаотропной смесью, поскольку высокие концентрации соли денатурируют белки, разрушают гидрофобные взаимодействия и повышают растворимость неполярных веществ.

2. И 600 мкл хлороформа

Хлороформ облегчает разделение водной и органических фаз. Обычно водная фаза формирует верхнюю фазу.

3. Активно перемешать на вортексе до полной гомогенизации.

4. Центрифугировать при 12500 об/мин в течении 5 минут.

После центрифугирования все органические остатки уходят в осадок и в центральную часть (пленка), а освобожденная ДНК остается в верхней фракции.

Этап 4: Осаждение ДНК

1. Аккуратно переместить верхнюю прозрачную фракцию в чистую пробирку, не касаясь носиком центральной пластинки.
2. К отделенной жидкости добавить максимально возможное количество 95–100 % этанола, охлажденного до –20°С.

Данный этап, как правило, называют осаждением. ДНК растворяется в воде, но нерастворима в спиртах, поэтому добавление этанола (часто холодного) заставляет ее выпадать в осадок и слипаться, становясь видимой.

3. Перевернуть пробирку несколько раз до появления видимого сгустка ДНК.

Этап 5: Очистка, растворение и оценка качества

1. Центрифугировать 3 мин на максимальных оборотах. Полностью удалить жидкость из пробирки, оставив ДНК на ее стенке.
2. Сушить с открытой крышкой в течении 10–15 мин.
3. Добавить желаемый объем ТЕ буфера (Трис-ЭДТА, предотвращает воздействие на ДНК клеточных нуклеаз, поскольку связывает необходимые для их работы катионы Mg ²⁺ ).
4. Перемешать на мультивортексе до полного растворения ДНК.
5. Оценить качество и концентрацию выделенной ДНК на спектрофотометре или при помощи гель электрофореза.

Рис. 1. Оценка качества на спектрофотометре

Качество выделенной ДНК оценивалось с помощью двух критически важных коэффициентов чистоты. Первый, A260/A280, характеризует степень загрязнения препарата белками; его оптимальное значение лежит в диапазоне 1.8–2.0. Все замеры образцов (1.839–1.871) соответствуют этой норме, указывая на минимальное содержание белковых примесей. Второй коэффициент, A260/A230, отражает наличие остаточных солей, фенола или других органических соединений; желательным считается значение выше 1.8.

В ходе проведенной работы, мной был использован фенол-хлороформный метод экстракции ДНК из цельной крови. Анализ подтвердил высокую чистоту и выход полученной ДНК. Проведена детальная оценка фенольного метода экстракции, что позволило выявить его преимущества и недостатки.

Основное преимущество фенольного метода выделения ДНК — высокая чистота получаемой ДНК , что делает его пригодным для широкого спектра применений.

Недостатками являются токсичность реагентов (фенол и хлороформ) и сложность процесса .

Выводы:

1. Изучен большой объем литературы и интернет-ресурсов по моей исследовательской работе;
2. Необходимо соблюдать все меры техники безопасности в лаборатории, так как работа связана с человеческим биоматериалом и химическими веществами;
3. Процесс выделения ДНК трудоемкий, требующий большой концентрации внимания, сноровки и большого объема знаний в нескольких областях наук, сам процесс очень интересный и увлекательный;
4. Изучены преимущества и недостатки выделения ДНК по методу Мэтью.

Заключение

Я получила первый большой опыт работы в генетической лаборатории и огромное количество знаний, которые пригодятся мне в будущем и станут надежным фундаментом на просторах науки.

Литература:

1. Mathew C. C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in molecular biology. — Human Press, 1984. — Vol. 2. — P. 31–34.
2. Anbalagan D., Yap G., Yuan Y., Pandey V. K., Lau W. H., et al. Annexin-A1 Regulates MicroRNA-26b* and MicroRNA-562 to Directly Target NF-kB and Angiogenesis in Breast Cancer Cells // PLoS ONE. — 2014. — Vol. 9(12): e114507. — URL: https://journals.plos.org/plosone/article/file?type=printable&id=10.1371/journal.pone.0114507 (дата обращения: 16.12.2025).
3. Квачадзе Т. Что такое ДНК: три важные буквы последних лет [Электронный ресурс]. — URL: https://trends.rbc.ru/trends/social/644a1e999a7947df16915f50 (дата обращения: 16.12.2025).
4. Рябова А. Е. Теоретические основы ДНК [Электронный ресурс]. — URL: https://vniigen.ru/wp-content/uploads/2023/07/Рябова-А.Е.-теоретические-основы-ДНК.pdf (дата обращения: 16.12.2025).
5. Методы выделения ДНК из различных биологических образцов [Электронный ресурс]. — URL: https://www.s-vfu.ru/universitet/rukovodstvo-i-struktura/instituty/bgf/nilmb_bgf/Методы%20выделения%20ДНК%20из%20различных%20биологических%20образцов.pdf (дата обращения: 16.12.2025).
6. DNA extraction from blood [Электронный ресурс]. — URL: https://fac.ksu.edu.sa/sites/default/files/dna_extraction_from_blood_0.pdf (дата обращения: 16.12.2025).
7. Протокол выделения ДНК [Электронный ресурс]. — URL: http://molbiol.ru/protocol/14_02.html (дата обращения: 16.12.2025).