Динамика уровней L-лактата и ферритина сыворотки крови при экспериментальной мезентериальной ишемии



В данной статье авторы-исследователи пытаются ответить на вопрос — существует ли связь между динамикой концентрации таких биомаркеров как L-лактат и ферритин в сыворотке крови при возникновении нарушений мезентериального кровотока в эксперименте. Для этого 47 крыс были поделены на 3 группы: группа контрольных интактных крыс, группа из 2 подгрупп крыс SHAM для хирургического контроля, экспериментальная группа крыс с моделированием мезентериальной ишемии по авторской методике с подгруппами без восстановления кровотока после ишемии и с восстановлением кровотока на 60 минут. Были получены результаты, свидетельствующие о том, что концентрация L-лактата при мезентериальной ишемии статистически значимо повышается по сравнению с контролем. При этом уровень L-лактата также значимо повышается при проведении реперфузии после ишемии по сравнению с подгруппой без восстановления кровотока. Изучение уровня ферритина сыворотки крови показало, что его концентрация в данном исследовании не зависит от мезентериальной ишемии.

Ключевые слова: биомаркеры, мезентериальная ишемия, L-лактат, ферритин, иммуноферментный анализ.

Несмотря на малую распространённость такой патологии как острые нарушения мезентериального кровообращения, среди всего многообразия хирургических заболеваний — не более 1 случая на 1000 госпитализаций, ошибки в диагностике данного состояния приводят к плачевным результатам — летальность от данной патологии даже в странах с высоким уровнем медицины составляет 60–80 % [1]. До настоящего времени ранняя клиническая и лабораторная диагностика ишемических состояний кишечника остаётся проблемой нерешённой и зачастую хирургическое вмешательство проводится пациентам с уже выраженной клинической картиной [2]. Многими исследователями предлагается искать возможности ранней диагностики острых нарушений мезентериального кровотока путём изучения динамики уровня различных биомаркеров, таких как L-лактат и ферритин [3].

Наиболее противоречивые результаты исследований имеются по L-лактату: часть исследователей считает, что данный маркер не имеет диагностической ценности [4, 5], другие сообщают, что L-лактат является подходящим для ранней диагностики явлений мезентериальной ишемии в отделениях неотложной помощи и возможности быстрого определения его уровня портативными устройствами [6, 7], третьи же пишут о прогностической ценности данного маркера, но отмечают низкую специфичность [8]. Таким образом L-лактат является интересным маркером в плане изучения его уровня при патологиях мезентериального кровотока.

Период постишемической реперфузии считается критическим периодом в лечении данного заболевания из-за окислительного повреждения тканей [9]. Однако до настоящего момента течение постреперфузионного периода изучено недостаточно [10]. Имеются данные о прогностической значимости такого биомаркера как ферритин, отражающего степень окислительного стресса, которому подвергается организм после реперфузии [11]. Таким образом, изучение уровня ферритина в зависимости от цикла ишемия-реперфузия в эксперименте может расширить наши знания о прогностической роли данного маркера.

Высокая смертность среди пациентов с нарушениями мезентериального кровотока свидетельствует о необходимости проведения исследований с целью получения новой информации о ранней диагностике данной патологии и для принятия решений о тактике лечения [12].

Цель исследования — оценить значимость определения уровней L-лактата и ферритина сыворотки крови в динамике развития мезентериальной ишемии на модели у крыс.

Материал и методы. Экспериментальное исследование проведено на 47 половозрелых белых лабораторных крысах с массой от 150 до 180 г, сопоставимых по полу и возрасту. Исследование проводилось с учётом биологических ритмов — все манипуляции по реализации модели мезентериальной ишемии осуществлялись в одно и то же время суток. Все инвазивные оперативные манипуляции и последующая эвтаназия животных выполнялись под общей анестезией путём однократной внутримышечной инъекции раствора кетамина. Экспериментальные манипуляции проводились с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18.03.1986 г.). Проведение данного исследования одобрено решением Комитета по биоэтике Карагандинского Государственного Медицинского Университета.

Экспериментальные животные (n=47) были поделены на 3 группы: группа 1 — интактные крысы (n=5) — крысы без проведения оперативного вмешательства, но с введением в состояние наркоза; группа 2 — группа хирургического контроля SHAM (n=10) — крысы, которым проводилась лапаротомия без моделирования мезентериальной ишемии с забором крови через 30 и 90 минут для соответствия сроками наблюдения в экспериментальных подгруппах, по 5 крыс в каждой из 2 подгрупп SHAM; группа 3 — крысы с моделью мезентериальной ишемии (n=32), группа включала в себя 2 подгруппы: подгруппа со сроком ишемии/реперфузии: 30 минут/без реперфузии — 16 крыс и подгруппа со сроком ишемии/реперфузии: 30 минут/реперфузия 60 минут — 16 крыс.

Крысам группы SHAM производилась лапаротомия с выведением части тонкой кишки через лапаротомную рану на стерильное операционное поле с последующим немедленным погружением обратно в брюшную полость без моделирования. Данная группа является контролем хирургического вмешательства, которая позволяет доказать, что изменения в результатах не вызваны оперативными манипуляциями.

В данном исследовании использовался авторский метод создания экспериментальной модели мезентериальной ишемии-реперфузии, зарегистрированный как объект авторского права (Тургунов Е. М., Аманова Д. Е., Ивачёв П. А., Коробейников Т. С. Метод моделирования мезентериальной ишемии у крыс (произведение науки). Свидетельство о государственной регистрации прав на объект авторского права № 2573 от 7.08.2018. Астана: РГП НИИС РК; 2018).

Все оперативные процедуры выполнялись с соблюдением правил асептики и антисептики, с использованием стерильных хирургических инструментов, с применением стерильного обкладочного материала при создания операционного доступа. Модель мезентериальной ишемии формировалась путём аподактильного клипирования каудальной мезентериальной артерии крыс, согласно анатомическим ориентирам, описанным в литературных источниках [13]. Для компрессии мезентериальных сосудов крыс использовались однотипные хирургические гемостатические зажимы размерами 15*3*2 мм.

В зависимости от того к какой группе исследования принадлежит крыса гемостатический зажим на краниальной брыжеечной артерии оставляется на различное время — этап ишемии (рис. 1). С наступлением окончания требуемого срока ишемии зажим аподактильно снимается для восстановления кровообращения в ранее ишемизированной кишке. Данный этап называется реперфузией и имитирует хирургическое лечение мезентериальной ишемии.

Рис. 1. Ишемизированная тощая кишка крысы на одном из этапов осуществления экспериментальной модели мезентериальной ишемии

Забор крови осуществлялся у наркотизированного животного пункционно через грудную клетку из полостей сердца, аспирировалось 2–3 мл крови в пробирку с активатором свёртывания. Выведение из эксперимента производилось путём обескровливания с соблюдением норм руководства Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации по эвтаназии животных (AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition).

Определение концентраций L-лактата и ферритина в сыворотке осуществляется методом твердофазного хромогенного иммуноферментного анализа на роботизированной системе Evolis от Biorad с помощью наборов реагентов для крови крыс производства Cloud-Clone Corp. (США). Для определения уровня L-лактата использовался набор ELISA Kit for LA CEV643Ge (чувствительность теста 3,12 нг/мл, диапазон концентраций 7,41–600 нг/мл). Для ферритина использовался набор ELISA Kit for FTH SED021RA (чувствительность теста составляет 1,35 нг/мл, диапазон концентраций 3,12–200 нг/мл).

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием IBM SPSS Statistics 20. Для каждого показателя рассчитывались среднее значение (М), стандартное отклонение (SD), медиана (Мe), межквартильный интервал (IQR). Статистические гипотезы на достоверность проверялись непараметрическими методами такими, как критерий Манна-Уитни для 2 независимых групп для оценки количественных данных и критерий Краскела-Уоллиса для k независимых выборок для определения значимости результатов в подгруппах при различных сроках реперфузии. Обработка результатов производилась с применением приемов статистической поправки на малый размер выборки. Принятый уровень значимости различий в группах — p<0,05.

Результаты. Данные исследования уровней L-лактата и ферритина сыворотки крови при мезентериальной ишемии в группах интактных крыс и крыс SHAM с использованием критерия Краскела-Уоллиса для k-независимых групп продемонстрированы в таблице 1.

Таблица 1

Сравнительный анализ результатов уровней L-лактата и ферритина в группах интактных крыс и SHAM

Группы и подгруппы		Ферритин (ng/ml)		L-лактат ( ng/ml)
	N	Me	IQR	Me	IQR
Интактные	5	0,243	0,131	1,583	0,529
SHAM 30 мин	5	0,157	0,054	1,194	1,112
SHAM 90 мин	5	0,196	0,049	1,760	0,785
k (степени свободы)		3		3
Z (значение критерия)		3,86		4,94
p		0,145		0,085

На данным, представленным в таблице 1, можно сделать вывод, что уровень данных биомаркеров не превышает пороговых значений и не имеет статистически значимых отличий (р≥0,05), таким образом изолированная лапаротомия (группа SHAM) в сравнении с введением животных в состояние наркоза (интактные) не приводят к существенной гипоксии кишечной стенки.

Результаты сравнительной оценки уровней ферритина и лактата между группой с моделью ишемии 30 минут / без реперфузии и соответствующей ей группы SHAM с использованием критерия Манна-Уитни для независимых выборок отображены в таблице 2.

Таблица 2

Сравнение значений маркеров подгруппы ишемия 30 мин / без реперфузии с подгруппой SHAM 30 мин

Подгруппы		Ферритин (ng/ml)		L-лактат ng/ml)
	N	Me	IQR	Me	IQR
Ишемия 30 мин / без реперфузии	16	0,133	0,029	2,322	1,102
SHAM 30 мин	5	0,157	0,054	1,194	1,112
Z (значение критерия)		-1,529		-2,395
p		0,13		0,015

Согласно полученным результатам отмечается статистически значимое повышение уровня лактата сыворотки крови (в 1,9 раз) в группе с 30-минутной ишемией без реперфузии в сравнении с соответствующей группой контроля SHAM (p=0,015, р<0,05). Значимых изменений уровня ферритина в группе с моделированием ишемии 30 минут без реперфузии в сравнении с контрольной группой SHAM не выявлено (р=0,13, p≥0,05).

При сравнении результатов между группами ишемии 30 минут с реперфузией 60 мин с группой контроля SHAM с использованием критерия Манна-Уитни для независимых выборок (таблица 3) значимых различий уровня ферритина не выявлено (p=0,062, p≥0,05).

Таблица 3

Сравнение значений маркеров подгруппы ишемия 30 мин / реперфузия 60 мин с подгруппой SHAM 90 мин

Подгруппы		Ферритин (ng/ml)		L-лактат ( ng/ml)
	N	Me	IQR	Me	IQR
Ишемия 30 мин / реперфузия 60 мин	16	0,161	0,076	2,162	0,472
SHAM 90 мин	5	0,196	0,049	1,760	0,785
Z (значение критерия)		-1,899		-2,147
p		0,062		0,032

В таблице 3 можно увидеть, что уровень L-лактата в 1,2 раза повышен в группе ишемии 30 мин / реперфузия 60 мин и данное повышение статистически значимо в сравнении с контрольной группой SHAM (p=0,032, р<0,05).

При сравнении значений уровня ферритина между экспериментальными группами с использованием критерия Манна-Уитни значимых различий не выявлено (p=0,196, p≥0,05), что представлено в таблице 4.

Таблица 4

Сравнительный анализ результатов уровней L-лактата и ферритина в подгруппах сравнения

Подгруппы		Ферритин ( ng / ml )		L-лактат ( ng/ml )
	N	Me	IQR	Me	IQR
Ишемия 30 мин / без реперфузии	16	0,133	0,029	2,323	1,102
Ишемия 30 мин / реперфузия 60 мин	16	0,158	0,076	2,482	0,476
Z (значение критерия)		-1,301		-2,035
p		0,196		0,043

В таблице 4 можно наблюдать, что уровень L-лактата незначительно повышен в группе ишемии 30 мин / реперфузия 60 мин и данное повышение статистически значимо в сравнении с группой ишемии 30 мин / без реперфузия (p=0,043, р<0,05).

При сравнении суммарных значений уровней биомаркеров между экспериментальными группами (с моделированием ишемии и реперфузии) и группами контроля SHAM с использованием критерия Манна-Уитни зафиксированы значимые различия уровней ферритина и L-лактата. Данные значений приведены в таблице 5.

Таблица 5

Сравнение суммарных значений маркеров между группами сравнения и группами SHAM

Группы		Ферритин ( ng/ml )		L-лактат ( ng/ml )
	N	Me	IQR	Me	IQR
Ишемия (2 подгруппы)	32	0,140	0,061	2,420	0,740
SHAM (2 подгруппы)	10	0,189	0,040	1,633	0,842
Z (значение критерия)		-2,245		-2,953
p		0,024		0,002

В таблице 5 можно увидеть, что медиана значений концентрации ферритина в группе SHAM повышена в 1,35 раза в сравнении с экспериментальной группой (p=0,024). Уровень L-лактата статистически значимо увеличен в 1,5 раза в экспериментальной группе в сравнении с контрольной группой SHAM (р=0,002).

Заключение. Изучение динамики уровней L-лактата и ферритина сыворотки крови при экспериментальной мезентериальной ишемии показало, что концентрация L-лактата статистически значимо (p=0,015, 0,032) повышается при данном состоянии по сравнению с контролем (в 1,2–1,9 раза). Кроме того уровень L-лактата также зависит от проведения реперфузии после ишемии — уровень данного маркера незначительно (7 %), но статистически значимо повышается (p=0,043) при проведении 60 минутной реперфузии с восстановлением мезентериального кровотока, что может быть связано с поступлением продуктов метаболизма из ишемизированной ткани в системный кровоток. При этом тот факт, что уровень L-лактата продолжает повышаться и после реперфузии говорит также и о том, что его клиническая значимость в диагностике острых ишемических состояний кишечника может быть под вопросом. Изучение уровня ферритина сыворотки крови показало, что его концентрация в данном исследовании не зависит (p≥0,05) от возникновения такого состояния, как мезентериальная ишемия. Напротив, при сравнении суммарных результатов экспериментальной группы с группой контроля наблюдается статистически значимое (p=0,024) уменьшение концентрации ферритина в сыворотке крови крыс экспериментальных групп. Можно предположить, что существует какой-либо механизм разрушения ферритина попадающими в системный кровоток продуктами метаболизма из ишемизированных тканей кишечника.

Литература:

1. Clair D. G., Beach J. M. Mesenteric Ischemia. The New England Journal of Medicine. 2016 Mar 10;374(10):959–68. doi: 10.1056/NEJMra1503884.
2. Carver T. W., Vora R. S., Taneja A. Mesenteric Ischemia. Crit Care Clin. 2016 Apr;32(2):155–71. doi: 10.1016/j.ccc.2015.11.001.
3. Stroeder J., Bomberg H., Wagenpfeil S., Buecker A., Schaefers H. J., et al. Presepsin and Inflammatory Markers Correlate With Occurrence and Severity of Nonocclusive Mesenteric Ischemia After Cardiovascular Surgery. Crit Care Med. 2018 Jun;46(6):e575-e583. doi: 10.1097/CCM.0000000000003091.
4. Destek S., Yabacı A., Abik Y. N., Gul V. O., Deger K. C. Predictive and prognostic value of L-lactate, D-dimer, leukocyte, C-reactive protein and neutrophil/lymphocyte ratio in patients with acute mesenteric ischemia. Ulus Travma Acil Cerrahi Derg. 2020 Jan;26(1):86–94. doi: 10.14744/tjtes.2019.61580.
5. Acosta S., Nilsson T.. Current status on plasma biomarkers for acute mesenteric ischemia. J Thromb Thrombolysis. 2012 May;33(4):355–61. doi: 10.1007/s11239–011–0660-z.
6. Aydin B., Ozban M., Serinken M., Kaptanoglu B., Demirkan N. C., Aydin C. The place of D-dimer and L-lactate levels in the early diagnosis of acute mesenteric ischemia. Bratisl Lek Listy. 2015;116(5):343–50. doi: 10.4149/bll_2015_094.
7. Akoz A., Turkdogan K. A., Kahraman Cetin N., Kum S., Duman A. Predicting critical duration and reversibility of damage in acute mesenteric ischemia: An experimental study. Ulus Travma Acil Cerrahi Derg. 2018 Nov;24(6):507–513. doi: 10.5505/tjtes.2018.69710.
8. Memet O., Zhang L., Shen J. Serological biomarkers for acute mesenteric ischemia. Ann Transl Med. 2019 Aug;7(16):394. doi: 10.21037/atm.2019.07.51.
9. Santos C. H. M., Aydos R. D., Nogueira E. Neto, Miiji L. N., Cassino P. C., et al. Ischemic Postconditioning Assessment in the Liver of Rats Undergoing Mesenteric Ischemia and Reperfusion. Braz J Cardiovasc Surg. Jul-Sep 2016;31(4):287–290. doi: 10.5935/1678–9741.20160068.
10. Cagin Y. F., Atayan Y., Sahin N., Parlakpinar H., Polat A., et al. Beneficial effects of dexpanthenol on mesenteric ischemia and reperfusion injury in experimental rat model. Free Radic Res. 2016;50(3):354–65. doi: 10.3109/10715762.2015.1126834.
11. Park Y. Y. Ischemia/reperfusion Lung Injury Increases Serum Ferritin and Heme Oxygenase-1 in Rats. Korean J Physiol Pharmacol. 2009;13(3):181–87. doi: 10.4196/kjpp.2009.13.3.181.
12. Nuzzo A., Huguet A., Corcos O. Modern treatment of mesenteric ischemia. Presse Med. 2018 Jun;47(6):519–530. doi: 10.1016/j.lpm.2018.03.019.
13. Ноздрачев А. Д., Поляков Е. Л. Анатомия крысы. — Санкт-Петербург: Лань, 2001. — 203–204 с.