Исследование нового системного биохимического показателя функции митохондрий



В последние годы наблюдается рост числа исследований по поиску новых специфичных системных маркеров для оценки митохондриальной дисфункции среди циркулирующих белков, связанных с функционированием митохондрий [1, 2, 3]. Открытый в конце XX века белок PGC1a (peroxisomeproliferator-activatedreceptorgammacoactivator 1-alpha, 1α-коактиватор γ-рецептора, активирующего пролиферацию пероксисом) [4] на сегодняшний день рассматривается как один из главных факторов регуляции процессов экспрессии генов митохондриальных белков с обоих геномов, репликации мтДНК и образования новых митохондрий. Изменение синтеза белка PGC1a и экспрессии соответствующего гена обнаружено при различных патологических состояниях [5, 6], что позволило рассматривать данный белок и связанные с ним сигнальные пути в качестве новой перспективной мишени для терапевтического воздействия [7, 8]. Новые данные об экстрануклеарной локализации и функции PGC1а в клетке [9, 10] указывают на наличие внутриклеточных транспортных систем для данного белка, а также позволяют предположить возможность его экзоцитоза. В данной работе впервые проведено исследование уровня белка PGC1а в крови.

В настоящей работе проведена оценка белка PGC1a в качестве потенциального системного маркера митохондриальной дисфункции в сравнении с известными метаболическими показателями функции митохондрий (молочная и пировиноградная кислоты, аминокислоты, цитохром С). Исследования выполнено в когорте лиц с нарушением гемодинамики и начальными признаками сердечной недостаточности вследствие патологии выходного тракта левого желудочка сердца.

Материал иметоды исследования

Материал исследования — плазма крови, взятой из кубитальной вены утром натощак в вакутейнеры с цитратом натрия или ЭДТА в качестве антикоагулянтов. Процедуру отделения форменных элементов крови проводили в течение не более 20 минут от момента взятия крови. Образцы до анализа хранили при температуре –80 ºС.

Были исследованы образцы крови от 94 пациентов (61 мужчина и 33 женщины) в возрасте от 30 до 77 лет с распределением по возрасту 61 (55–64) лет. Все пациенты имели нарушение гемодинамики вследствие патологии выходного тракта левого желудочка сердца: аневризмы восходящего отдела аорты (n=69) или аортального стеноза (n=25). Диагноз аортального стеноза и дилатации аорты верифицировался по результатам трансторакального эхокардиографического исследования на аппарате Vivid 7 (GE, США) согласно Европейским/Американским рекомендациям по эхокардиографии по стандартному протоколу.Основным критерием отбора пациентов в исследование была пиковая скорость на аортальном клапане (Vmax) более 4,0 м/с и расширение восходящего отдела аорты более 45 мм. 57 пациентов имели клинические признаки сердечной недостаточности соответствующие II функциональному классу по классификации Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA ФК II). Оставшиеся 37 пациентов составили подгруппу NYHA ФК I.

В качестве группы сравнения исследованы образцы от 64 здоровых лиц (17 мужчин и 47 женщин) в возрасте от 18 лет до 61 года. Критериями включения в группы сравнения были удовлетворительное самочувствие, отсутствие хронических заболеваний и острых воспалительных процессов по результатам анкетирования.

Концентрацию молочной кислоты (МК) в плазме крови определяли колориметрически с помощью лактатоксидазного теста по набору Витал Девелопмент Корпорэйшн(Россия). Концентрацию пировиноградной кислоты (ПВК) определяли в безбелковом ультрафильтрате плазмы с использованием лактатдегидрогеназы.

Уровень белков определяли с помощью коммерческих наборов реактивов для иммуноферментного анализа: PGC1а (1альфа-коактиватор гамма-рецептора, активирующего пролиферацию пероксисом; UscnLifeScienceInc., КНР), цитохром С (BenderMedSystemsGmbH, Австрия).

Аминокислотный профиль плазмы определяли путем обращенно-фазного ВЭЖХ-анализа депротеинизированных образцов с использованием колонки ZorbaxEclipseAAAC18 (150 х 4,6 мм, 3,5 мкм). Осуществляли предколоночную дериватизацию ортофталевым альдегидом, а измерение флуоресценции элюата проводили при длине волны возбуждения 340 нм и испускания 455 нм. Концентрации аминокислот рассчитывали, используя норвалин в качестве внутреннего стандарта.

Статистическую обработку результатов выполняли с использованием пакета программ SAS 9.3. Данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха (Me(Q1-Q3)). Для оценки межгрупповых различий использован непараметрический критерий Манна-Уитни. Корреляционный анализ проведен с применением критерия Спирмена. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы принимали равным 0,05.

Результаты. Относительно здоровых лиц пациенты характеризовались повышением уровней МК (р<0,0001), Ала (p=0,026) и Сер (p=0,0001), а также отношения МК/ПВК (р<0,0001). Выход в кровоток белка цитохрома С (CytC) наблюдался у каждого шестого пациента, что свидетельствует о митохондриальной дисфункции, сопровождающейся инициацией апоптоза клеток у части пациентов.

Референтный интервал для МК в плазме венозной крови согласно литературным сведеньям составляет 0,5–2,2 мМ [11]. 95-ый перцентиль значений концентрации МК у лиц группы сравнения был значительно ниже верхней границы референтного интервала и составил 1,1 мМ. В виду полученной разницы значения МК у пациентов в пределах от 1,1 до 2,2 мМ в настоящей работе интерпретировались как умеренное повышение уровня МК, а термин «гиперлактатемия» употреблялся в случаях, когда концентрация МК в крови превышала 2,2 мМ. Концентрация МК превышала уровень в 1,1 мМ у половины пациентов (44 из 94, 47 %). Выше 2,2 мМ уровень МК был у 10 лиц (11 %), то есть у каждого десятого пациента наблюдалась гиперлактатемия.

Для Ала у пациентов, помимо повышения относительно здоровых лиц, также обнаружено изменение концентрации, согласованное с изменением уровней МК и ПВК. Корреляционный анализ выявил положительную связь между МК и Ала (r_s=0,50; p=0,0001) и ПВК и Ала (r_s=0,50; p=0,0003). Концентрация Ала была достоверно выше у пациентов с уровнем МК выше 1,1 мМ в сравнении с пациентами с более низким уровнем МК — 452 (407–501) и 385 (293–485) мкМ соответственно (р=0,013). У лиц уровнем МК выше 2,2 мМ дальнейшего повышения концентрации Ала не наблюдалось. Ала — аминокислота, способная превращаться в ПВК, а также обратно синтезироваться с использованием углеродного скелета ПВК, в результате одной обратимой реакции трансаминирования. Поэтому повышение концентрации Ала характерно для состояний, связанных с нарушением функции комплексов дыхательной цепи и пируватдегидрогеназы [12], и используется как один из лабораторных признаков при диагностике митохондриальных заболеваний [13].

В группе пациентов относительно здоровых лиц обнаружено повышение концентрации PGC1а почти в два раза (р<0,0001) — 112,5 (61,0–164,6) и 61,0 (61,0–67,8) нг/л, соответственно. Группа здоровых лиц характеризовалась не только низким уровнем PGC1а, но и небольшим разбросом значений концентрации данного белка (CV %=13,5) в сравнении с пациентами, у которых концентрация PGC1а колебалась в больших пределах — CV %=72,8. 95-ый перцентиль значений уровня PGC1а в группе сравнения составил 86 нг/л. Концентрация PGC1а была выше 86 нг/л у 67 % пациентов (χ²=7,83; р<0,01 в сравнении с частотой отклонений уровня МК от 1,1 мМ; χ²=50,48; р<0,01 в сравнении с частотой высокого уровня CytC у пациентов).

Высокий уровень PGC1а обнаруживался с одинаковой частотой как у пациентов с уровнем МК ниже 1,1 мМ (n=50), так и у пациентов с умеренным повышением уровня МК (n=34), и составил в данных подгруппах 123,5 (73,4–171,5) и 120,7 (61,0–161,9) нг/л, соответственно. Но у пациентов с уровнем МК выше 2,2 мМ (n=10) наблюдался более низкий уровень PGC1а, составивший 61,0(61,0–107,0) нг/л, чем у остальной части пациентов — 122,1(65,9–167,4) нг/л (p=0,03). Таким образом, в подгруппах пациентов в зависимости от уровней МК: 1) до 1,1 мМ, n=50; 2) от 1,1 до 2,2 мМ, n=34; 3) выше 2,2 мМ, n=10, обнаружено повышение частоты встречаемости низких значений уровня PGC1а (ниже 86 нг/л) с ростом концентрации МК. В подгруппе 3 пациентов с гиперлактатемией частота встречаемости уровня PGC1а ниже 86 нг/л составила 70 % и была достоверно выше, чем подгруппе 1–28 % (χ²=6,46; р<0,05).

Высокий уровень CytC достоверно чаще встречался среди лиц с низким уровнем PGC1a (30 %) по сравнении с пациентами у кого концентрация PGC1a превышала 86 нг/л (10 %; χ²=5,90; р<0,05). В целом концентрация PGC1a у лиц с высоким уровнем CytC составила 71,0(61,0–156,4) нг/л против 118,0(65,9–164,6) нг/л у лиц без повышения CytC (р=0,083).

Обсуждение результатов изаключение. Упациентов с начальной стадией сердечной недостаточности обнаружено повышение концентрации PGC1а в плазме крови в среднем практически в 2 раза относительно здоровых лиц. Согласно нашим данным, повышение концентрации PGC1а в крови не связано с увеличением неспецифической проницаемости клеточных мембран, и, вероятно, объясняется более сложным механизмом, требующим дальнейшего изучения. Отклонение от значений в группе сравнения для PGC1a, у пациентов встречались достоверно чаще, чем повышение МК (в 1,5 раза), ПВК (в 5 раз) и случаи высокого уровня CytC (в 4 раза). Исходя из полученных данных, для PGC1a можно ожидать более высокую диагностическую чувствительность, в сравнении с другими биохимическими показателями, использующимися в настоящее время для оценки функции митохондрий. Однако, выявленные закономерности в изменении уровня PGC1а относительно других показателей функции митохондрий, а именно увеличение частоты случаев гиперлактатемии и выхода CytC в кровоток при низком уровне PGC1a у пациентов, характеризуют данный белок как показатель с невысокой прогностичностью отрицательного результата. По-видимому, уровень PGC1а в крови зависит от нарушения использования энергетических метаболитов митохондрионом. Роль увеличения содержания PGC1а в крови при отсутствии гиперлактатемии в механизме регуляции обновления митохондриона на органном уровне требует дальнейшего изучения. У пациентов с умеренным повышением уровня МК высокое содержание PGC1а в крови может характеризовать стадию стимуляции образования так называемых гигантских митохондрий [14], образующихся в мышечных тканях, в том числе, при старении организма [15]. Нельзя исключить значительное прямое влияние тканевого ацидоза на биосинтез и процессинг PGC1а и других белков. В экспериментах на мышах показано, что хроническое повышение уровня МК в тканях сопровождается снижением экспрессии гена PGC1а и нарушением биогенеза митохондрий [16].

Тем не менее, принимая во внимание недостаточное количество в настоящее время специфичных диагностических показателей для оценки митохондриальной дисфункции, преаналитические и аналитические сложности определения таких распространенных показателей как МК и ПВК, PGC1a является перспективным маркером для оценки функции митохондрий, требующими дальнейшего изучения. Полученные результаты о присутствии белка PGC1a в системном кровотоке также имеют значение для разработки малоинвазивных способов мониторинга терапии энергодефицитных состояний, предполагающей воздействие на биогенез митохондрий [7].

Литература:

1. Suomalainen A., Elo J. M., Pietiläinen K. H., Hakonen A. H., Sevastianova K., Korpela M., Isohanni P., Marjavaara S. K., Tyni T., Kiuru-Enari S., Pihko H., Darin N., Õunap K., Kluijtmans L. A., Paetau A., Buzkova J., Bindoff L. A., Annunen-Rasila J., Uusimaa J., Rissanen A., Yki-Järvinen H., Hirano M., Tulinius M., Smeitink J., Tyynismaa H. FGF-21 as a biomarker for muscle-manifesting mitochondrial respiratory chain deficiencies: a diagnostic study // Lancet Neurol. — 2011. — V. 10, № 9. — P. 806–818.
2. Davis R. L., Liang C., Edema-Hildebrand F., Riley C., Needham M., Sue C. M. Fibroblast growth factor 21 is a sensitive biomarker of mitochondrial disease // Neurology. — 2013. — V. 81, № 21. — P.1819–1826.
3. Yatsuga S., Fujita Y., Ishii A., Fukumoto Y., Arahata H., Kakuma T., Kojima T., Ito M., Tanaka M., Saiki R., Koga Y. Growth differentiation factor 15 as a useful biomarker for mitochondrial disorders // Ann. Neurol. — 2015. — V. 78, № 5. — P. 814–823.
4. Puigserver P., Wu Z., Park C. W., Graves R., Wright M., Spiegelman B. M. A cold-inducible coactivator of nuclear receptors linked to adaptive thermogenesis // Cell. — 1998. — V. 92, № 6. — P. 829–839.
5. Finck B. N., Kelly D. P. PGC-1 coactivators: inducible regulators of energy metabolism in health and disease // J. Clin. Invest. — 2006. — V. 116, № 3. — P. 615–622.
6. Villena J. A. New insights into PGC-1 coactivators: redefining their role in the regulation of mitochondrial function and beyond // FEBS J. — 2015. — V. 282, № 4. — P. 647–672.
7. Wenz T. PGC-1alpha activation as a therapeutic approach in mitochondrial disease // IUBMB Life. — 2009. — V. 61, № 11. — P. 1051–1062.
8. Schilling J., Kelly D. P. The PGC-1 Cascade as a therapeutic target for heart failure // J. Mol. Cell. Cardiol. — 2011. — V. 51, № 4. — P. 578–583.
9. Aquilano K., Vigilanza P., Baldelli S., Pagliei B., Rotilio G., Ciriolo M. R. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator 1 alpha (PGC-1α) and sirtuin 1 (SIRT1) reside in mitochondria: possible direct function in mitochondrial biogenesis // J. Biol. Chem. — 2010. — V. 285, № 28. — P. 21590–21599.
10. Lettieri Barbato D., Baldelli S., Pagliei B., Aquilano K., Ciriolo M. R. Caloric restriction and the nutrient-sensing PGC-1α in mitochondrial homeostasis: new perspectives in neurodegeneration // Int. J. Cell Biol. — 2012. — V. 2012. — P. 759583.
11. Клиническая оценка лабораторных тестов / Под ред. Н. У. Тица: Пер. с нем. — М.: Медицина, 1986. — 480 с.
12. Clarke C., Xiao R., Place E., Zhang Z., Sondheimer N., Bennett M., Yudkoff M., Falk M. J. Mitochondrial respiratory chain disease discrimination by retrospective cohort analysis of blood metabolites // Mol. Genet. Metab. — 2013. — V. 110, № 1–2. — P. 145–152.
13. Wolf N. I., Smeitink J. A. Mitochondrial disorders: a proposal for consensus diagnostic criteria in infants and children // Neurology. — 2002. — V. 59, № 9. — P. 1402–1405.
14. Liesa M.,Palacín M.,Zorzano A. Mitochondrial dynamics in mammalian health and disease // Physiol. Rev. — 2009. — V. 89, № 3. — P. 799–845.
15. Coleman R.,Silbermann M.,Gershon D., Reznick A. Z. Giant mitochondria in the myocardium of aging and endurance-trained mice // Gerontology. — 1987. — V. 33, № 1. — P. 34–39.
16. Ogasawara E., Nakada K., Hayashi J. Lactic acidemia in the pathogenesis of mice carrying mitochondrial DNA with a deletion // Hum. Mol. Genet. — 2010. — V. 19, № 16. — P. 3179–3189.