Надежность ПЦР-анализа при обнаружении m.tuberculosis и мутации гена rpoB при исследовании различного диагностического материала | Статья в журнале «Молодой ученый»

Библиографическое описание:

Нуритдинов З. Х., Мурмусаева Г. К., Джураев Ж. Р., Абдуллаев Р. Р., Ташпулатова Ф. К., Пулатов Ж. А. Надежность ПЦР-анализа при обнаружении m.tuberculosis и мутации гена rpoB при исследовании различного диагностического материала // Молодой ученый. — 2014. — №16. — С. 123-125. — URL https://moluch.ru/archive/75/12773/ (дата обращения: 18.10.2018).

Введение: Проблема лекарственной устойчивости (ЛУ) m.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам остается на сегодняшний день актуальной. Нужно отметить что, наряду с легочной формой ТБ наблюдается тенденция к нарастанию внелегочных форм ТБ. С 2002 по 2011 гг. не наблюдалось тенденций к снижению показателей регистрации внелегочного ТБ, тогда как распространенность ТБ сокращалась. В результате этого доля пациентов с внелегочным ТБ возросла с 16 % в 2002 г. до 22 % в 2011 г. Так как симптомы этой формы ТБ размыты или могут напоминать симптомы других заболеваний, врачи могут поздно диагностировать внелегочный ТБ или вообще не распознавать его [2]. Клиническое значение определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) возбудителя, выделанных от больных туберкулезом, в максимально короткие сроки постоянно возрастает, что связано, в первую очередь, с появлением штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ), устойчивых к нескольким противотуберкулезным препаратам (ПТП), в первую очередь с множественной (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) [1]. Генетическая устойчивость к тому или иному ПТП проявляется вследствие спонтанных хромосомных мутаций, происходящих при частоте от 10–6 до 10–10 репликацией микобактерий. Развитие лекарственной устойчивости МБТ к рифампицину связано с возникновением мутаций в гене rpoB. Мутации, приводящие к устойчивости, препятствуют связыванию препарата с ферментом и расположены, главным образом, в определенной области гена rpoB, получившей название «участок, определяющий устойчивость к рифампицину». У 86 % штаммов МБТ устойчивость к рифампицину связана с заменой одной их трех аминокислот: Ser531Leu (41 %), His526Leu (36 %) или Asp516Tyr (9 %) [1]. Необходимо отметить, что применяемые на сегодняшний день микробиологические методы выявления и характеристики микобактерий, являясь основными методами диагностики туберкулеза, весьма трудоемки, дороги, плохо стандартизуемы и длительны, что существенно снижает диагностическую ценность проводимых исследований, увеличивает сроки постановки и подтверждения диагноза, приводит к позднему выявлению больных — активных бактериовыделителей, вынуждает врачей эмпирически назначать противотуберкулезную терапию и не позволяет проводить своевременную коррекцию лечения в случае развития устойчивости [6]. Таким образом, актуальной темой в мировом масштабе для ранее диагностики внелегочных форм ТБ является разработка и применение ускоренных и эффективных методов исследований. С появлением ПЦР стало возможным в миллионы раз увеличить концентрацию определенных фрагментов ДНК в комбинированном генетическом материале за несколько часов [3]. Одним из важнейших функций ПЦР является идентификация патогенных микроорганизмов, возбудителей заболеваний человека, животных и растений [4].

Cистема GeneXpert была запущена в эксплуатацию в Узбекистане 2012 г. «Xpert MTB/RIF» — тест система в формате картриджа, где проходит выделение ДНК МБТ из диагностического материала пациента, мультиплексная ПЦР в режиме реального времени (REAL-TIME-PCR) для одновременного выявления МБТ и определения генетических детерминант лекарственной устойчивости (мутаций) к рифампицину в гене rpoB МБТ и автоматическая интерпретация результатов реакции в молекулярном анализаторе «GeneXpert» [1,5]. Тест Xpert MTB/RIF имеет аналитическую чувствительность пяти геномных копий очищенных ДНК и 131 КОЕ/мл M. tuberculosis, добавленных к мокроте [3]. Молекулярные маяки, которые нацелены на ген «rpoB», охватывают все мутации, обнаруженные в >99,5 % штаммов, устойчивых к рифампицину [3].

Цель исследования: изучить эффективность выявления m.tuberculosis при исследовании различного диагностического материала с применением ПЦР в режиме реального времени на платформе Xpert MTB/RIF.

Материалы и методы исследования: Исследования проводилась в Национальной Референс лаборатории Республиканского специализированного научно-практического медицинского центра Фтизиатрии и Пульмонологии в г. Ташкент. Для достижения поставленной цели было обследовано диагностические материалы, таких как: операционный материал, моча, спинномозговая жидкость и др. взятых у 354 больных. Из них мужчины составили 213 (60 %) и женщины 141 (40 %). Исследованнные образцы с целью диагностики составляло у 247 (70 %) и ранее леченнқх 108 (30 %). Некоторые из диагностических материалов до проведения теста были деконтаминированы с помощью NaOH (Гидроксид натрия) или NALC (N — ацетил — L — цистеин) методом посева на питательные среды.

Результаты и обсуждения: Из 354 больных было выявлено 113 (40 %) положительных МБТ результатов. Мутации в гене rpoB, которая спровоцировала резистентность к противотуберкулезному препарату рифампицин, составила у 38 (30 %), чувствительность у 75 (60 %), чувствительность не определено у 12 (10 %). Проведенный анализ позволил выявить из 113 пациентов с отрицательным результатом микроскопии 50 положительных результатов МБТ. Т. е. у 50 пациентов микроскопия с отрицательным результатом была подтверждена молекулярно генетическим методом положительно, из них 14 (28 %) МЛУ. Среднее время детектирования на аппарате GeneXpert составило для одного теста в среднем 2 часа, для микроскопии 1 день. Подробная информация о результатах исследования представлена в таблице 1.

Таблица 1

Результаты исследования на оборудования GeneXpert

Диагностический материал

Всего обс.

RIF устойчивость

RIFчувствительность

МБТ отрицательный

Ошибка теста

RIFне оценен

Плевральная жидкость

153

11

19

112

5

6

БАЛЖ

51

8

12

27

 

4

Операционный материал

46

11

21

12

1

1

Моча

44

1

1

38

4

 

Пунктаты

18

4

2

10

1

1

Спинномозговая жидкость

15

2

4

9

   

Гной

11

 

7

4

   

Кал

6

 

1

4

1

 

Гной из абсцесса

3

 

3

     

Лимфа узел

3

 

3

     

Выделение из влагалища

1

   

1

   

Выделение из лимфа узла

1

 

1

     

Выделение из свища

1

1

       

Суставная жидкость

1

 

1

     

Всего

354

38 (11 %)

75 (21 %)

217 (61 %)

12 (3 %)

12 (3 %)

Примечания:RIF — рифампицин,МБТ — микобактерии туберкулеза, RIF не оценен — чувствительность к рифампицину по техническим причинам не определено.

Выводы:

1.                  Тест Xpert MTB/RIF может использоваться в качестве начального диагностического теста у лиц с подозрением на ТБ легочных и внелегочных патологиях.

2.                  Внедрение в практику молекулярно генетического метода Xpert MTB/RIF основанная на ПЦР в режиме реального времени значительно сокращает сроки проведения исследования, что верифицирует диагноз ТБ за 2 часа.

3.                  Быстрое выявление МЛУ-ТБ больных позволяет изолирование и начало раннего лечения противотуберкулезными препаратами.

4.                  Проведения анализа на аппарате GeneXpert сокращает образования инфекционных аэрозолей по сравнению с културальными методами, что дает возможность снизить риск распространение инфекции внутри лаборатории.

Литература:

1.                  Литвинова В. И., Морозова А. М. Лабораторные исследования при туберкулезе. — М.: МНПЦБТ, 2013. — С. 121–151.

2.                  Доклад ВОЗ/ECDC от 19 марта 2013 г. Чтобы остановить туберкулез в Европе, необходимо обеспечить надлежащее лечение. [электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.euro.who.int/ru/media-centre/sections/press-releases/2013/03/adequate-treatment-essential-to-stop-tuberculosis-across-europe-whoecdc-new-report (дата обращения: 22.09.2014)

3.                  Sigma-Aldrich. Количество ПЦР — анализ — техническое руководство. — С. 3.[электронный ресурс]. Режим доступа: www.galatrade.ru/pages/files_download.php?id=38 (дата обращения: 22.09.2014)

4.                  Глик. Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с. Англ. — М.: Мир, 2002. — С. 96.

5.                  Быстрое внедрение диагностического теста Xpert MTB/RIF: технические и операционные рекомендации. — С. 5–6. ВОЗ 2011.

6.                  Афанасьева М. В. Молекулярное типирование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis: дисс. канд. мед. наук. — М., 2008. — C. 3.

Основные термины (генерируются автоматически): RIF, MTB, лекарственная устойчивость, реальное время, генетический метод, операционный материал, спинномозговая жидкость, внелегочная форма ТБ, NALC, REAL-TIME-PCR.


Похожие статьи

Эффективность молекулярно-генетического метода GeneXpert...

MTB, RIF, молекулярно-генетический метод, отрицательный результат, прогностическая ценность, лекарственная устойчивость, установленный диагноз, расчет показателей информативности, Беларусь...

Эффективность молекулярно-генетического метода GeneXpert...

MTB, RIF, молекулярно-генетический метод, отрицательный результат, прогностическая ценность, лекарственная устойчивость, микроскопический метод, Беларусь, расчет показателей информативности...

Молекулярно-генетические методы обследования...

Xpert MTB/RIF высокочувствительный и специфичный тест определяющий одновременно МТБ комплекс

Всем больным были произведены плевральные пункции и биологический материал был

Бактериологические методы определения лекарственной устойчивости микобактерий...

Молекулярно-генетический анализ полиморфизма...

В настоящей работе охарактеризованы разработанные и апробированные молекулярно-генетические методы

В настоящее время для анализа чистоты пород широко используются традиционные методы, такие как анализ родословных и экстерьерных признаков.

Показатели белков острой фазы воспаления у больных...

изучение показателей белков острой фазы воспаления при острых формах бруцеллёза представляет определенный интерес.

Материалы иметоды исследования.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась методом вариационной статистики с...

Анализ инфекционных маркеров, ассоциированных...

Материал иметоды: Контингент: С апреля по июнь 2012 г. на базе

I этап— скрининг 2500 образцов сывороток крови доноров методом ИФА, с использованием тест-систем Российского производства

Niamh Mullen, Majority of TTI from first time donors; Medical Observer, 2012, Nov.

Бесконтактные методы активного онлайн контроля в жидких...

В случае совпадения сигнала сенсора с формой, уровнем и частотными характеристиками резонанса, уровнем диэлектрической

Система основана на возможностях резонансного метода контролировать разницу между мышечными тканями и жидкостью; базируясь на...

Экспериментальные модели аутоимунных патологических...

Скачать Спецвыпуск Материалы конференции «Актуальные вопросы патологии» (pdf).

Помимо возможности лечения так же исследуются более быстрые и точные методы диагностики.

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle

Похожие статьи

Эффективность молекулярно-генетического метода GeneXpert...

MTB, RIF, молекулярно-генетический метод, отрицательный результат, прогностическая ценность, лекарственная устойчивость, установленный диагноз, расчет показателей информативности, Беларусь...

Эффективность молекулярно-генетического метода GeneXpert...

MTB, RIF, молекулярно-генетический метод, отрицательный результат, прогностическая ценность, лекарственная устойчивость, микроскопический метод, Беларусь, расчет показателей информативности...

Молекулярно-генетические методы обследования...

Xpert MTB/RIF высокочувствительный и специфичный тест определяющий одновременно МТБ комплекс

Всем больным были произведены плевральные пункции и биологический материал был

Бактериологические методы определения лекарственной устойчивости микобактерий...

Молекулярно-генетический анализ полиморфизма...

В настоящей работе охарактеризованы разработанные и апробированные молекулярно-генетические методы

В настоящее время для анализа чистоты пород широко используются традиционные методы, такие как анализ родословных и экстерьерных признаков.

Показатели белков острой фазы воспаления у больных...

изучение показателей белков острой фазы воспаления при острых формах бруцеллёза представляет определенный интерес.

Материалы иметоды исследования.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась методом вариационной статистики с...

Анализ инфекционных маркеров, ассоциированных...

Материал иметоды: Контингент: С апреля по июнь 2012 г. на базе

I этап— скрининг 2500 образцов сывороток крови доноров методом ИФА, с использованием тест-систем Российского производства

Niamh Mullen, Majority of TTI from first time donors; Medical Observer, 2012, Nov.

Бесконтактные методы активного онлайн контроля в жидких...

В случае совпадения сигнала сенсора с формой, уровнем и частотными характеристиками резонанса, уровнем диэлектрической

Система основана на возможностях резонансного метода контролировать разницу между мышечными тканями и жидкостью; базируясь на...

Экспериментальные модели аутоимунных патологических...

Скачать Спецвыпуск Материалы конференции «Актуальные вопросы патологии» (pdf).

Помимо возможности лечения так же исследуются более быстрые и точные методы диагностики.

Задать вопрос