В настоящее время проблема стерильности сред и растительных эксплантов в биотехнологических лабораториях стоит достаточно остро. Причин попадания бактериальной и микотической инфекций много, но наиболее распространённые две: первая — это микроорганизмы которые попадают вместе с растением которое вводят впервые в культуру, и вторая это микроорганизмы которые попадают при какой либо работе с культурой ткани (чаще всего при пересеве культуры). [1. с. 137] Подробным изучением вопросов инфицирования растительных эксплантов культуры in vitro занялась научная исследовательская лаборатория биотехнологии Костромского государственного университета им. Некрасова. Исследования были направлены на изучение не только эффективных методов борьбы с инфицированием, но и на выявление закономерностей (в зависимости от условий и проводимых мероприятий с культурой растительных эксплантов), поражения грибковой и бактериальной инфекцией, а также на взаимное влияние инфицирующих агентов по отношению к эксплантам.
Рис. 1. Орхидея Фаленопсис выделяет после введения в культуру в среду фенолы для борьбы с инфекцией. Среда при этом темнеет.
Нами были проведены наблюдения которые позволили выявить, то что поражение грибковой инфекцией чаще всего обнаруживается у растений которые были введены в культуру впервые, это по-видимому связано с тем что при стерилизации материнского растения споры грибов оказываются более стойкими, или находятся в месте недоступном для веществ которыми проводят стерилизацию. Бактериальная инфекция на этом этапе встречается гораздо меньше примерно на каждые 100 растений 8–15 оказываются уже после ввода в культуру поражены грибковой инфекцией и только 2–3 бактериальной. Иная картина наблюдается при дальнейшей работой с культурой при повторных пересевах растительных эксплантов увеличивается число культуры поражённой бактериальной инфекцией и становится 5–6 на 100 растений, а грибковая несколько снижается — 7–10 на 100 растительных эксплантов. Выводя общую закономерность мы пришли к выводу о том, что поражение грибковой инфекцией встречается чаще, чем бактериальной. Это можно объяснить тем, что грибы все-таки менее требовательны к среде поскольку группы ферментов которые они выделяют способствуют усвоению питательных веществ практически из любого субстрата, бактерии в этом отношении более требовательны и предпочитают расти на средах с большим содержанием органических веществ, что конечно не даёт среда Мурасиге применяемая для выращивания растительных эксплантов содержащая в основном минеральные вещества.
Рис. 2. Стерильные растительные экспланты Осины обыкновенной
Нами были также проведены исследования и наблюдения об отношении инфекции различной этиологии к эксплантам, в ходе которых были установлены ряд закономерностей в дальнейшем позволивших прогнозировать судьбу инфицированных эксплантов. Так грибковая инфекция вела себя очень агрессивно практически ко всем растениям вызывая чаще всего быструю гибель растения. Единственно у хвойных растений грибковая инфекция не вызывала быструю гибель, но значительно тормозила развитие. Такое поведение плесени связано скорей всего с образованием фитонцидов растениями приводящим к торможению развития грибковой инфекции. Таким образом при обнаружении растений пораженных плесенью мы наверняка знали что такое растение для дальнейшего культивирования совершенно не годится. Колонии бактерий образующиеся на среде как правило активному развитию растений не препятствовали росли на среде медленно, но когда такая колония доходила до экспланта она сначала тормозила развитие, а затем приводила к гибели растения. При обнаружении нами бактериальной инфекции особенно в начале развития некоторые растительные экспланты можно было сохранить предварительно проведя противобактериальные мероприятия и пересеяв на стерильную среду Мурасиге.
Таким образом на основании наших исследований и наблюдений мы пришли к выводу о том, что в настоящее время наиболее остро стоит именно проблема грибковых инфекций растительных эксплантов, поэтому перед лабораторией биотехнологии поставлена задача разработать наиболее эффективные способы борьбы с грибковой инфекцией, поскольку против бактерий имеются эффективные средства борьбы — антибиотики, а против плесени средств которые можно использовать в среде где выращивают растительные экспланты — нет.
Рис. 3. Стерильный растительный эксплант
При подборе таких препаратов которые были бы эффективны против грибковых и бактериальных инфекций конечно необходимо учитывать ряд очень важных моментов. Антибиотики которые в настоящее время применяют в клональном микроразмножении растений не смотря на то что губительно действуют на микроорганизмы могут также угнетать не только дифференциацию тканей растения путём антагонирования растительных гормонов, но также могут оказывать непосредственно токсическое влияние на сами экспланты повреждая белоксинтезирующий аппарат клетки, что приводит к резкому ухудшению приживаемости эксплантов не говоря уже о росте и развитии. [2. с. 110] На среде содержащей антибиотики дифференциация ткани происходила примерно в два раза медленней чем на той же среде но без антибиотика. Это может крайне негативно сказаться например при использовании биотехнологических методов в коммерческих целях, поскольку происходит замедление получения большого количества посадочного материала. Наиболее часто в настоящее время используются антибиотики широкого спектра действия: пенициллинового и цефалоспоринового ряда. Есть ещё одно негативное явление при использовании антибиотиков: многие из них не выдерживают нагревания при стерилизации сред, при этом либо разрушаются либо вступают в химические реакции с веществами входящими в состав среды. Ещё хуже дела обстоят с грибковой инфекцией. Фунгицидные средства обладают еще более токсичным действием на растительные экспланты, как правило, убивая не только грибковую инфекцию но и растительные клетки, приводя к гибели культуры ткани. [5. с. 120] До сих пор надёжного средства борьбы с плесенью в культуре растительной ткани не разработано. Это связано с тем, что грибы обладают уникальными механизмами приспособления к жизни в крайне неблагоприятных условиях.
Рис. 4. Растительный эксплант пораженный грибковой инфекцией.
Поэтому необходимо вести поиски средств, которые бы оказывали прямое антагонистическое воздействие на процессы метаболизма плесени.
Необходимо также уделить немного внимания проблемам вирусной инфекции, которая не попадает из окружающего воздуха, и даже не вносится при работе с культурой ткани. Она постоянно находится в растениях. Сначала материнских, а затем уже отделённые растительные экспланты пораженные вирусом попадают на питательную среду. Заметного вреда вирус на культуру ткани не оказывает. Но если сравнить например растение картофеля выращенного из безвирусного материала и картофель который содержал вирусные частицы, то результат будет вероятней всего неожиданным. У безвирусного картофеля будут мощно развиты плети, клубней будет не только больше по количеству но они так же будут значительно крупней по сравнению с картофелем содержащим вирусные частицы. [4. с. 95].
Рис. 5. Фиалка, выросшая из культуры тканей.
Подводя вывод можно сказать, что несмотря на то что биотехнология значительно продвинулась в методике и технологии культивирования растительного материала, в плане стерильности как питательных сред так и материнских растений, а также соблюдении стерильности при работе с растительными тканями, биотехнология стоит чуть ли не на первобытном уровне, поскольку до сих пор не возможно сделать культуры растительных эксплантов свободными от бактериальной, грибковой и вирусной инфекций.
Литература:
1. Егорова Т. А. Основы биотехнологии. / Т. А. Егорова [и др.] — М.: ACADEMA, 2003. — 208 с.
2. Егоров Н. С. Биотехнология. Проблемы и перспективы./ — М.: Высшая школа. – 1987. — 159 с.
3. Березин И. В., Яцимирский А. К. Биотехнология и ее перспективы. Серия «Биология» № 11. — М.: Знание. — 1986
4. Биотехнология — сельскому хозяйству/ Под ред. Лобанка А. Г. — Минск: Ураджай. — 1988. — 198с.
5. Емцев В. Т. Рубежи биотехнологии./– М.: Агропромиздат. — 1986. — 159с.
6. Фотографии из личного архива.
