В статье авторы пытаются изучить пленкообразующую способность грамположительных и грамотрицательных условно-патогенных бактерий на различных полимерных материалах.
Ключевые слова: пленкообразующая способность, биопленки, дренажная трубка, катетер-ассоциированные инфекции.
Актуальность. ВИЧ-инфицированные пациенты поступают в лечебные учреждения зачастую в связи с развитием сопутствующей оппортунистической инфекции. Развитие СПИД-ассоциированных бактериальных суперинфекций существенно усугубляет и без того тяжелое состояние пациентов, что нередко требует оказания медицинской помощи с применением аппаратов для искусственной вентиляции легких и различных инвазивных процедур. При этом используются различные медицинские изделия из силикона (внутривенные и мочевые катетеры, дренажные и соединительные трубки). Уникальные свойства кремний-органических соединений послужили широкому их применению в медицине. Однако возникла проблема, связанная с инфекционными осложнениями, ассоциированными с формированием на них биопленок. Биопленка — сообщество микробов, которые прикреплены к поверхности и/или друг к другу, заключены в матрикс из синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ. [1] Примечательно, что сами бактерии составляют лишь 5–35 % массы биопленки, остальная часть — это межбактериальный матрикс. [2] Входящие в такие микроконсорциумы бактерии имеют измененный фенотип, проявляющийся другими параметрами роста и экспрессии специфичных генов, что в значительной степени повышает их устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов физической, химической и биологической природы по сравнению со свободно плавающими бактериями, а также к воздействию антибиотиков, эффекторам защиты макроорганизма, дегидратации, вирусам и даже ультрафиолетовому излучению [3, 4].
Катетеры и дренажные трубки могут длительно находиться в теле человека и быть не только хорошими проводниками возбудителей инфекций, нарушая такие важные оборонительные барьеры, как кожа, слизистые, сфинктеры мочеиспускательного канала, но и местом образования биопленок. [5] Полимерные имплантаты, покрывшись биопленкой, могут стать «бомбой замедленного действия» и «взорваться» септическим шоком в результате отрыва от нее и попадания в кровоток большого количества бактериальных клеток.
Цель работы: изучить пленкообразующую способность грамположительных и грамотрицательных условно-патогенных бактерий на различных полимерных материалах.
Материалы иметоды. Вкачестве объектов исследования использовали штаммы Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis и Klebsiella pneumoniae. Бактерии выращивали на мясо-пептонном агаре, культивируя в термостате при 37°С в течении 24 часов. Чистую суточную культуру микроорганизмов петлей перенесли в пробирку с питательным бульономLuria-Bertani (LB), выращивали 18 часов в условиях термостата до достижения логарифмической фазы роста. Бактериальный инокулюм стандартизировали по МакФарланду до 2,0, затем разводили стандартизированные культуры в LB-бульоне в отношении 1/100. Полученную суспензию вносили по 150 мкл для культивирования в две 96-луночные плоскодонные стерильные полистироловые панели для иммунологических исследований. Исследование проводилось в 5 повторах. В один из микропланшетов перед инокуляцией помещали образцы, вырезанные из дренажной трубки в виде дисков диаметром 5 мм, часть из которых раскладывали ее наружной поверхностью кверху, другую — внутренней. Панели закрывали стерильной крышкой и выдерживали в течении 24 часов в условиях термостата при 37°С. Планктонные клетки удаляли путем 3-х кратного промывания панелей дистиллированной водой. Затем их сушили на фильтровальной бумаге в перевернутом виде, содержимое лунок окрашивали 0,1 % раствором кристаллического фиолетового в течении 40 минут, связавшийся краситель экстрагировали 96 % этанолом в течение 30 минут. Биомассу пленок оценивали по оптической плотности полученных экстрактов на планшетном спектрофотометре «ChroMate» при длине волны 492 нм.
Результаты исследований иобсуждение. При сравнении пленкообразующей способности исследуемых микроорганизмов в лунках полистиролового микропланшета установлено, что K. pneumoniae, как и можно было ожидать, проявили наибольшую пленкообразующую способность, поскольку общепризнанно, что уровень биопленкообразования у грамотрицательных микроорганизмов значительно выше, чем у грамположительных, за счет продукции более мощного матрикса. К тому же встроенный в стенку K. pneumoniae липополисахарид стабилизирует мембрану и повышает общий отрицательный заряд бактерии, что повышает ее способность к адгезии.
Результаты сравнительного изучения пленкообразования грамположительных и грамотрицательных условно патогенных бактерий на наружной и внутренней поверхностях дренажной трубки показали, что пленкообразующая способность оппортунистических микроорганизмов независимо от грампринадлежности выше на наружной поверхности образца. В технологии изготовления подобных изделий внутреннюю поверхность делают более гладкой с целью уменьшения адгезии и увеличения эффективности оттока. Неровности поверхности материала обычно способствуют бактериальной адгезии и образованию биопленок [6] Например, зачастую на внутривенных катетерах образуют биопленки S. epidermidis, S. aureus, что приводит к бактериальному эндокардиту и сепсису. Эти бактерии могут попадать в кровоток со слизистых и кожных покровов, в том числе и по наружной стороне катетера, шероховатость которой может обусловливать повышение как площади поверхности, так и количества микровпадин, которые обеспечивают более привлекательные места для микробной колонизации. [7]
Наиболее выраженная способность к формированию биопленки на наружной поверхности силиконового образца отмечена у S. aureus, что подтверждает большую вероятность сорбирования бактерий с более гидрофобными покровами, по сравнению с гидрофильными. [8]
Анализируя пленкообразование на внутренней поверхности полимерного диска, обнаружили, что K. pneumoniae вновь проявляли большую активность, чем другие микроорганизмы. Образование биопленок включают в себя две основные функциональные фазы: первичную адгезию с адаптацией бактерий к поверхности и формирование клеточных слоев и кластеров, обусловленное продукцией внеклеточного полимерного матрикса. [9] Особенности поверхностных структур и продукция мощного матрикса создает предпосылки к образованию биопленки даже на внутренней поверхности полимерных изделий.
Выводы. Образование биопленок на силиконовых изделиях имеет важное значение для практической медицины, в частности при оказании помощи больным СПИДом. Оказалось, что оппортунистические микроорганизмы могут проявлять высокую пленкообразующую способность на полимерных материалах, что служит фактором дополнительного риска при их использовании. Проведенное исследование позволило получить информацию о способности клинических штаммов формировать биопленки. Так, сравнительный анализ количественных данных показал, что наиболее выраженной способностью к образованию биопленки на наружной поверхности дренажной трубки из силикона обладал S. aureus, а на внутренней — K. pneumoniae.
Литература:
- Tetz V. V. The effect of antimicrobial agents and mutagen on bacterial cells in colonies // Med Microbiol. Lett. — 1996. — № 5. — С. 426–36.
- Мальцев С. В., Мансурова Г. Ш. Что такое биопленка? // Практическая медицина. — 2011. — № 5 (53). — С. 7–10.
- Watnick P., Kolter R., Biofi lm, city of microbes // J Bacteriol. — 2000. — № 182. — С. 2675–9
- Costerton J. W., Stewart P. S., Greenberg E. P. Bacterial biofi lms: a common cause of persistent infections // Science. — 1999. — № 284. — С. 1318–22
- Романова Ю. М., Диденко Л. В., Толордава Э. Р. и др. Биопленки патогенных бактерий и их роль в хронизации инфекционного процесса. Поиск средств борьбы с биопленками // Вестник РАМН. — 2011. — № 10. — С. 31–39.
- Scheuerman T. R., Camper A. K., Hamilton M. A. Effects of Substratum Topography on Bacterial Adhesion // Journal of Colloid and Interface Science. — 1998. — № 208. — С. 23–33.
- Katsikogianni M., Missirlis Y. F.. Concise review of mechanisms of bacterial adhesion tobiomaterials and of techniques used in estimating bacteria-material interactionsm // European cells & materials. — 2005. — № 8. — С. 37–57.
- M. C. M. van Loosdrecht, J. Lyklema, W. Norde, A. J. B. Zehnder. Bacterial adhesion: A physicochemical approach // Microbial Ecology. — 1989. — № 17. — С. 1–15.
- Mah T-FC, O'Toole GA. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents // Trends Microbiology. — 2001. — № 9 — С. 34–39
