Библиографическое описание:

Новиков Д. Г. Особенности воспалительного инфильтрата и атрофии в параканкрозной и дистантной зонах слизистой оболочки желудка у больных раком желудка кишечного типа, носителей полиморфных аллелей генов цитокинов // Молодой ученый. — 2012. — №3. — С. 447-452.

Введение. Helicobacter pylori запускает хроническую воспалительную реакцию в слизистой оболочке желудка (СОЖ) [1]. Воспаление, в свою очередь, оказывает повреждающее действие на СОЖ, приводя к определенной последовательности молекулярно-биологических и морфологических нарушений, отражением чего служит появление в СОЖ атрофических изменений, за которыми следует развитие дисплазии/неоплазии, а затем и рака желудка кишечного типа (РЖКТ) [2]. Особенности течения данной воспалительной реакции у индивидуума могут быть обусловлены носительством полиморфных аллелей генов цитокинов, обеспечивающих более выраженный воспалительный ответ [3] и ассоциированных с развитием РЖКТ [4]. Однако биологические эффекты носительства полиморфных аллелей генов цитокинов и их роль в регуляции воспаления при развитии рака желудка оценивались только на основании сведений о содержании цитокинов в сыворотке крови. При этом особенности проявлений воспаления в СОЖ, связанные с носительством полиморфных аллелей генов цитокинов, остаются недостаточно изученными.

Цель исследования: установить особенности хронического воспаления и атрофии слизистой оболочки желудка у больных раком желудка кишечного типа с учетом носительства полиморфных аллелей генов цитокинов, регулирующих воспаление.

Задачи исследования: 1) Оценить особенности воспалительного инфильтрата и атрофию в параканкрозной и дистантной зонах СОЖ у больных РЖКТ и раком желудка диффузного типа (РЖДТ).

2) Сопоставить особенности воспалительного инфильтрата СОЖ с носительством полиморфных аллелей генов цитокинов, регулирующих воспаление, у больных РЖКТ.

3) Изучить особенности атрофических изменений в СОЖ с учетом носительства полиморфных аллелей генов цитокинов, регулирующих воспаление, у больных РЖКТ.

Материалы и методы исследования. Было выполнено когортное одномоментное сравнительное контролируемое исследование. В исследуемую группу были включены 82 больных РЖКТ, в группу сравнения - 34 больных РЖДТ. В группах проводилось гистологические, иммуногистохимические исследование. Дополнительно в первой группе проводилось генетическое исследование. Контрольная группа включала 104 здоровых донора и была сформирована для оценки частот полиморфных аллелей генов цитокинов в исследуемой популяции. Объектом исследования был операционный материал резецированного желудка. Забор фрагментов СОЖ проводили в соответствии с требованиями Международной классификации хронического гастрита OLGA [5] (дистантная зона СОЖ). Дополнительно забирался фрагмент опухоли и СОЖ, расположенной на границе с опухолью (параканкрозная зона). Для оценки атрофии и выраженности воспаления в СОЖ использовали таблицы Российского пересмотра международной классификации хронического гастрита OLGA [6]. Иммуногистохимическое исследование выполняли с использованием первичных ready to use мышиных моноклональных антитела к CD4 (клон - 1F6), CD8 (клон - 144B), CD138 (клон - MI15) («DAKO», Дания), CD20 (клон - L26), CD68 (клон - KP1) («Diagnostic Biosystems», США) и кроличьих поликлональных антитела к IgA, IgGDAKO», Дания) с системой визуализации «Histofine». Подсчет клеток в собственной пластинке СОЖ проводился на 1000 клеток, вычислялось процентное их соотношение.

Для определения полиморфных локусов C+3953T, C-511T гена IL-1β и VNTR-полиморфизма во 2 интроне гена IL-1RN в лейкоцитах периферической крови применяли метод полимеразной цепной реакции с использованием наборов ИХБФМ СО РАН (г.Новосибирск), полиморфных локусов G-308A гена TNF-α и G-1082A гена IL-10 - наборы «SNP-экспресс» (НПФ «Литех», Россия).

Для статистического анализа достоверности различий использовались критерии: хи-квадрат (χ2), Манна – Уитни (U), Краскела-Уоллеса (H). Оценку соответствия частот аллелей закону Харди-Вайнберга проводили на он-лайн калькуляторе: http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl.

Результаты исследования и их обсуждение. Было показано, что уровень воспаления в СОЖ, оцененный как степень хронического гастрита у больных РЖКТ, коррелирует с количеством исследуемых полиморфных аллелей, носителем которых является данный больной (R=0,66, p=0,03). Обнаруженная корреляция, вероятно, связана с функциональной ролью в регуляции хронического воспаления в СОЖ исследуемых полиморфных аллелей. [4]. Предполагается, что носительство этих полиморфных аллелей приводит к повышенной продукции цитокинов как на начальных этапах воспаления, так и при персистенции воспалительного инфильтрата в СОЖ [7]. У носителей данных аллелей наблюдается выраженный провоспалительный ответ [4], что является важным фактором прогрессирования каскада P.Correa [2].

В дальнейшем, больные РЖКТ были разделены на две подгруппы. Включение больного в подгруппу носителей «провоспалительного» генотипа указывало на преобладание в его генотипе исследуемых полиморфных аллелей генов цитокинов, как в гомозиготном, так и гетерозиготном состоянии (т.е. наличие 3 и более аллелей). Носители менее 3 исследуемых полиморфных аллелей были включены в подгруппу с «нормальным» генотипом. Правомерность такого подхода была показана E.M. El-Omar и соавторами, обнаруживших повышенный риск развития рака желудка у носителей 3-4 полиморфных аллелей генов цитокинов и применивших к подобным комбинациям аллелей дефиницию «провоспалительны генотип» [8]. В результате, при оценке состава воспалительного инфильтрата собственной пластинки СОЖ у больных РЖКТ нами было обнаружено, что в подгруппе больных с «провоспалительным» генотипом наблюдается достоверно более выраженная инфильтрация СОЖ CD20+ клетками (p=0,03). При этом доля CD20+ клеток в собственной пластинке СОЖ коррелирует с показателем градации воспаления в антральном отделе и теле желудка, оцененным по Международной классификации хронического гастрита OLGA (R=0,88, p=0,000… и R=0,083, p=0,000…, соответственно). A.Kotłowska-Kmieć et al. было показано, что количество CD20+ лимфоцитов в собственной пластинке СОЖ тесно ассоциировано с H.pylori-инфекцией и коррелирует с выраженностью морфологических проявлений гастрита у детей, значительно снижаясь при эрадикации инфекта [9]. Однако хроническое воспаление и развитие атрофии в более позднем возрасте в большом проценте случаев способствуют спонтанной эрадикации инфекта. Несмотря на это, инфильтрация СОЖ CD20+ лимфоцитами сохраняется, что, по-видимому, обусловленно теми же механизмами, что и развитие эксхеликобактерного гастрита у детей [10]. Таким образом, увеличение доли CD20+ клеток, при более выраженной градации воспаления в собственной пластинке СОЖ у больных РЖКТ может указывать на длительность течения воспалительной реакции, регулируемой носительством «провоспалительного» генотипа.

Иммуногистохимическая оценка состава воспалительного инфильтрата в параканкрозной и дистантной зонах СОЖ показала, что у больных РЖКТ наблюдалась достоверно более выраженная инфильтрация CD20+ лимфоцитами собственной пластинки дистантной зоны СОЖ, в сравнении с параканкрозной зоной (p=0,000…). При этом количество CD20+ лимфоцитов находилось в положительной корреляционной связи с количеством плазматических клеток (CD138+) в собственной пластинке СОЖ (R=0,79, p=0,000…). Данная находка указывает на уже состоявшуюся реализацию хронического воспалительного ответа. При этом параканкрозная зона СОЖ, также как и в случае с CD20+ клетками, характеризовалась низкой плотностью плазмоцитарной инфильтрации. Эти результаты согласуются с данными, полученными И.А. Даниловой и Н.М. Аничковым, указывающими на уменьшение плотности плазмоцитарной инфильтрации параканкрозной зоны СОЖ у больных РЖКТ, происходящей параллельно с ростом опухоли и ее инвазией [11].

Аналогичные закономерности различия дистантной и параканрозной зон были получены и при оценке выраженности инфильтрации СОЖ IgA+ и IgG+плазмоцитами. В дистантной зоне СОЖ наблюдалась достоверно более выраженная инфильтрация IgA+ плазмоцитами, в сравнении с параканкрозной зоной (p=0,03). Кроме того в данной зоне встречались с большей частотой и IgG+ плазмоциты (p=0,000…). Дистантная зона СОЖ также характеризовалась большим значением соотношения IgG+/IgA+ плазмоцитов (0,39 против 0,18; p=0,032). Похожие результаты были показаны с помощью метода проточной цитометрии [12]. Следует обратить внимание на тот факт, что воспалительный ответ, протекающий по Th2 типу, традиционно рассматривался как ассоциированный с низким риском развития РЖКТ. [13]. В данном случае иммунный ответ по Th2 типу, наоборот, ассоциирован с РЖКТ. Вероятно, что принципиальной особенностью данного ответа, развивающегося по Th2 типу, является преключение синтеза IgA в плазмоцитах СОЖ на синтез IgG. При этом процесс переключения синтеза IgA/IgG плазматическими клетками как стереотипная реакция, развивающаяся при хроническом воспалении в слизистых оболочках, был описан А.В. Кононовым, обнаружившим нарастание продукции IgG в СОЖ, происходящее параллельно с эволюцией хронического гастрита от поверхностного до атрофического [14]. Появление синтеза IgG приводит к изменению особенностей воспалительной реакции в СОЖ. В отличие от IgA, связывание IgG с антигенами H.pylori приводит к активации системы комплемента и аттракции нейтрофильных лейкоцитов [15]. Дальнейший механизм канцерогенеза обусловлен токсическим воздействием на эпителиоциты СОЖ активных форм кислорода и азота, продуцируемых нейтрофильными лейкоцитами.

При оценке параканкрозной зоны нами была обнаружена достоверно более выраженная инфильтрация собственной пластинки СОЖ CD8+ лимфоцитами и CD68+ макрофагами (p=0,02 и p=0,000…, соответственно). Увеличение плотности макрофагальной инфильтрации [16] и количества цитотоксических Т-лимфоцитов в параканкрозной зоне СОЖ при РЖКТ было показано другими исследовательскими группами [17]. Инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки желудка CD8+ и CD68+ клетками, вероятно, является морфологическим проявлением неспецифических факторов защиты и иммунного ответа Th-1 типа, возникающего в ответ на развитие опухоли [18].

На основании полученных результатов оценки особенностей воспалительного инфильтрата в параканкрозной и дистантной зонах СОЖ с учетом носительства полиморфных аллелей генов цитокинов была составлена схема регуляции воспаления при

РЖКТ, отображенная на рисунке 1. На данной схеме разграничены дистантная и параканкрозная зоны СОЖ, что связано с поляризацией иммунного ответа по Th2 типу в дистантной зоне и по Th1 типу в параканкрозной зоне. В дистантной зоне СОЖ проявлением иммунного ответа, протекающего по Th2 типу, является выраженная инфильтрация СОЖ CD20+ лимфоцитами, в свою очередь, обусловливающая выраженную инфильтрацию СОЖ плазмоцитами (CD138+). Подобные особенности

Рис. 1. Регуляция воспаления в СОЖ при РЖКТ.


воспалительного инфильтрата дистантной зоны СОЖ, вероятно, отражают уже состоявшуюся реализацию хронического воспалительного ответа, еще одним проявлением которой является переключение синтеза плазматическими клетками с IgA на IgG [14]. Иммунные реакции, протекающие с участием IgG, приводят к активации системы комплемента и аттракции нейтрофильных лейкоцитов и моноцитов [15]. Возможно, что этой последовательностью клеточных взаимодействий объясняется обнаруженная нами корреляция между выраженностью инфильтрации CD20+ клетками собственной пластинки СОЖ и показателем градации воспаления в антральном отделе и теле желудка, оцененным по классификации OLGA. Вероятно, что обнаруженная поляризация является лишь закономерным финальным этапом эволюции хронического гастрита и, в действительности, развитию описанного иммунного ответа предшествовала его поляризация по Th1 типу, обусловившая в участках наибольшей выраженности развитие неоплазии. Тогда как стимуляция Th2 типа иммунного ответа, обнаруженная к моменту исследования, связана с истощением Th1 типа иммунного ответа дистантной зоны СОЖ и миграцией эффекторных клеток в зону опухоли и параканкрозную зону. Последним обстоятельством обусловлено обнаружение выраженной CD8+ и CD68+ инфильтрации параканкрозной зоны СОЖ. Также на данную схему нанесены особенности регуляции воспаления. Вопреки ожидаемым результатам, нам не удалось показать роль носительства отдельных полиморфных аллелей в регуляции воспаления в дистантной зоне СОЖ. Однако была показана роль «провоспалительного» генотипа, определявшего не только выраженность воспалительного инфильтрата, но и выраженную инфильтрацию СОЖ CD20+ клетками, которая может рассматриваться как косвенный маркер, отражающий роль данного генотипа в развитии хронического воспаления в собственной пластинке СОЖ.

При РЖДТ различия состава воспалительного инфильтрата между параканкрозной и дистантной зоной СОЖ отстутствовали, что, вероятно, связано с принципиально иным механизмом канцерогенеза, не носящем стадийного характера и не связанным с развитием хронического воспаления в СОЖ [19].

Нами также оценивались атрофические изменения СОЖ. У больных РЖКТ преобладал атрофический пангастрит, соответствующий стадиям III и IV. Подобные изменения в СОЖ обнаруживались у 76,8% больных. Аналогичную распространенность стадий III и IV хронического гастрита показали K. Satoh и др. на японской популяции [20]. У больных РЖДТ атрофические изменения СОЖ отсутствовали или были выражены слабо (стадии I-II хронического гастрита) - в 21,4%, 39,3% и 39,3%, случаев соответственно. Обнаруженные между группами различия объяснимы с позиций механизмов канцерогенеза в СОЖ. Стадийность процесса канцерогенеза при РЖКТ приводит к тому, что атрофические изменения СОЖ постепенно становятся более выраженными и на стадии III-IV хронического гастрита сопровождаются появлением неоплазии. При РЖДТ изменения в СОЖ не носят стадийный характер [19].

У больных РЖКТ было обнаружено наличие ассоциации атрофических изменений СОЖ, соответствующих стадии IV хронического гастрита с носительством полиморфного аллеля -511Т и генотипа -511 T/Т гена IL-1β (носительство данного аллеля и генотипа достоверно чаще встречалось у больных, атрофические изменения СОЖ которых соответствовали стадии IV, p=0,04). Наличие стадии IV хронического гастрита соответствует максимально выраженным атрофическим изменениям и фактически является заключительным этапом каскада P.Correa [2], предшествующим развитию неоплазии или продолжающимся параллельно с ее развитием. Однако наличие РЖКТ возможно уже на стадии III [20]. Как правило, резекция желудка проводится на максимально ранних сроках с момента диагностики РЖКТ, соответственно у больных не успевают развиться атрофические изменения, соответствующие стадии IV хронического гастрита. Однако носительство провоспалительного аллеля -511Т гена IL-1β, ассоциированное с повышенной продукцией IL-1β [7], вероятно, обусловливает выраженные провоспалительные эффекты цитокина [8], что способствует ускоренной прогрессии каскада P.Correa. В результате, развитие атрофических изменений в СОЖ происходит быстрее и, следовательно, к моменту появления неоплазии успевают развиться атрофические изменения, соответствующие стадии IV хронического гастрита. Обнаружение стадии IV хронического гастрита также было ассоциировано с носительством полиморфного аллеля -1082A и генотипа -1082A/A гена IL-10 у больных РЖКТ (носительство данного аллеля и генотипа достоверно чаще встречалось у больных, атрофические изменения СОЖ которых соответствовали стадии IV, p=0,025). Биологические эффекты IL-10, способствуют подавлению продукции цитокинов, регулирующих поляризацию иммунного ответа по Th-1 типу [21]. Учитывая функциональную роль однонуклеотидной замены G-1082A в гене IL-10 [7], можно предположить, что у носителей генотипа -1082A/A и аллеля -1082A снижен эффект подавления Th-1 иммунного ответа. В свою очередь поляризация иммунного ответа по Th-1 типу приводит к развитию выраженных атрофических изменений [22].


Выводы:

1)При РЖКТ имеются различия между параканкрозной и дистантной зонами СОЖ, характеризующиеся выраженной инфильтрацией дистантной зоны собственной пластинки СОЖ плазматическими клетками, продуцирующими IgG, находящейся в прямой корреляционной зависимости с выраженностью инфильтрации CD20+ лимфоцитами. Параканкрозная зона характеризуется выраженной инфильтрацией CD8+ лимфоцитами и CD68+ макрофагами. При РЖДТ различия между дистантной и параканкрозной зонами СОЖ отсутствуют.

2) Атрофические изменения параканкрозной и дистантной зон СОЖ у больных РЖКТ, носят выраженный характер и соответствуют стадиям III и IV хронического гастрита, у больных РЖДТ - отсутствуют или выражены слабо (стадии I и II хронического гастрита).

3) Показатель степени хронического гастрита у больных РЖКТ находятся в положительной корреляционной связи с количеством полиморфных аллелей генов C+3953T и C-511T IL-1β, VNTR в интроне 2 IL-1RN, G-1082A IL-10, G-308A TNF-α.

4) Выраженный мононуклеарный инфильтрат собственной пластинки слизистой оболочки желудка с высокой долей CD20+ лимфоцитов (степень 3 и 4 хронического гастрита) ассоциирован с носительством 3 и более полиморфных аллелей генов C+3953T и C-511T IL-1β, VNTR в интроне 2 IL-1RN, G-1082A IL-10, G-308A TNF-α у больных РЖКТ.

5) Наличие стадии IV хронического гастрита у больных РЖКТ, ассоциировано с носительством полиморфного аллеля -511Т и генотипа -511 T/Т гена IL-1β; полиморфного аллеля -1082A и генотипа -1082A/A гена IL-10.



Литература:

  1. Konturek P.C. Helicobacter pylori infection in gastric cancerogenesis / P.C. Konturek, S.J. Konturek, T. Brzozowski // Journal of physiology and pharmacology. – 2009. – Vol. 60, № 3. – P. 3-21.

  2. Correa P. Carcinogenesis of Helicobacter pylori / P.Correa, J. Houghton // Gastroenterology. – 2007. – Vol.133, №2. – P.659-672.

  3. Interleukin-1 polymorphisms associated with increased risk of gastric cancer/ E. M. El-Omar [et al.] // Nature. – 2000. – Vol. 404. – P.398-402.

  4. Shanks A.M. Helicobacter pylori infection, host genetics and gastric cancer / A.M. Shanks , E.M. El-Omar // Journal of digestive diseases. – 2009. – Vol.10, №3. – P.157-164.

  5. OLGA staging for gastritis: A tutorial / M. Rugge [et al.] // Digestive and liver disease. – 2008. – Vol.40, №8. – P.650-658.

  6. Аруин Л.И. Атрофический гастрит: проблемы обоснования морфологического диагноза (материалы к пересмотру международных классификаций - OLGA и Atrophy Club / Л.И. Аруин, А.В. Кононов, С.И. Мозговой // Актуальные вопросы патологической анатомии: Материалы III съезда Российского общества патологоанатомов. – Самара, 2009. – № 1. – С. 5-8.

  7. Smith A.J. Cytokine and cytokine receptor gene polymorphisms and their functionality / A.J. Smith , S.E. Humphries // Cytokine & growth factor reviews. – 2009. – Vol.20, №1. – P.43-59.

  8. Increased risk of noncardia gastric cancer associated with proinflammatory cytokine gene polymorphisms. / E.M. El-Omar [et al.] //. Gastroenterology. – 2003. – Vol. 124, №5. – P.1193-1201.

  9. Evaluation of selected immunocompetent cells expression in gastric mucosa in children with Helicobacter pylori infection before and after eradication treatment- a preliminary study / A. Kotłowska-Kmieć [et al] // Med Wieku Rozwoj. – 2007. – Vol. 11, № 4. – P.393-399.

  10. Кононов А.В. Helicobacter pylori – инфекция: генотип хозяина – фенотип гастрита / А.В. Кононов, Е.Г. Поморгайло, Е.А. Потрохова и др. // Материалы III съезда Российского общества патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии». – Самара, 2009. – С. 29-30

  11. Данилова И. А. Паренхиматозно-стромальные взаимоотношения при раке желудка кишечного типа / И. А. Данилова, Н. М. Аничков // Архив патологии. - 2011. - Т. 73, N 3. - С. 31-34.

  12. Decreased IgA antibody production in the stomach of gastric adenocarcinoma patients. / M. Quiding-Järbrink[et al.] //Clin Immunol. – 2009. – Vol. 131, № 3. – P.463-471.

  13. Intestinal helminthiasis in Colombian children promotes a Th2 response to Helicobacter pylori: possible implications for gastric carcinogenesis. / M.T. Whary [et al.] // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. – 2005. – Vol. 14, № 6. – P.1464-1469.

  14. Кононов А.В. Местный иммунитет и регенерация слизистых оболочек при хроническом воспалении (биопсийное исследование). Омск. 1993; С. 127-158.

  15. Brandtzaeg P. Update on mucosal immunoglobulin A in gastrointestinal disease. / P. Brandtzaeg // Curr Opin Gastroenterol. – 2010. – Vol.26, №6. – P.554-563.

  16. Association of Intra-tumoral Infiltrating Macrophages and Regulatory T Cells Is an Independent Prognostic Factor in Gastric Cancer after Radical Resection / B. Wang [et al.] // Annals of surgical oncology. – 2011. – Vol.18, №9. – P.2585-2593.

  17. Intratumoral expression of IL-17 and its prognostic role in gastric adenocarcinoma patients. / J.G. Chen [et al.] //Int J Biol Sci. – 2011. – Vol. 7, № 1. – P.53-60.

  18. Бережная Н. М. Иммунология злокачественного роста / Н. М. Бережная, В. М. Чехун. — Киев: Наукова думка, 2005. – 791с.

  19. Vauhkonen M. Pathology and molecular biology of gastric cancer / M. Vauhkonen, H. Vauhkonen, P. Sipponen // Best Prac & Res Clin Gastroenterol. – 2006. – Vol. 20, № 4. – P.651–674.

  20. Assessment of Atrophic Gastritis Using the OLGA System / K. Satoh [et al.] // Helicobacter. – 2008. – Vol.13, №3. – P.225-229.

  21. Белоцкий С.М. Воспаление и иммунный ответ в таблицах и рисунках. / С.М. Белоцкий, Р.Р. Авталион. – М. : Гончаръ, 2006. – 63 с.

  22. Fox G.J. Inflammation, atrophy, and gastric cancer. / G.J. Fox, T.C. Wang.// J Clin Invest. – 2007. – Vol.117, №1. – P.60-69.

Основные термины: хронического гастрита, полиморфных аллелей, полиморфных аллелей генов, аллелей генов цитокинов, больных РЖКТ, IV хронического гастрита, слизистой оболочки желудка, воспалительного инфильтрата, желудка кишечного типа, собственной пластинке СОЖ, стадии iv хронического, носительства полиморфных аллелей, иммунного ответа, хронического гастрита olga, классификации хронического гастрита, зоны СОЖ, носительством полиморфных аллелей, хронического воспаления, собственной пластинки СОЖ, атрофические изменения СОЖ

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle