Библиографическое описание:

Новиков Д. Г. Особенности воспалительного инфильтрата и атрофии в параканкрозной и дистантной зонах слизистой оболочки желудка у больных раком желудка кишечного типа, носителей полиморфных аллелей генов цитокинов // Молодой ученый. — 2012. — №3. — С. 447-452.

Введение. Helicobacter pylori запускает хроническую воспалительную реакцию в слизистой оболочке желудка (СОЖ) [1]. Воспаление, в свою очередь, оказывает повреждающее действие на СОЖ, приводя к определенной последовательности молекулярно-биологических и морфологических нарушений, отражением чего служит появление в СОЖ атрофических изменений, за которыми следует развитие дисплазии/неоплазии, а затем и рака желудка кишечного типа (РЖКТ) [2]. Особенности течения данной воспалительной реакции у индивидуума могут быть обусловлены носительством полиморфных аллелей генов цитокинов, обеспечивающих более выраженный воспалительный ответ [3] и ассоциированных с развитием РЖКТ [4]. Однако биологические эффекты носительства полиморфных аллелей генов цитокинов и их роль в регуляции воспаления при развитии рака желудка оценивались только на основании сведений о содержании цитокинов в сыворотке крови. При этом особенности проявлений воспаления в СОЖ, связанные с носительством полиморфных аллелей генов цитокинов, остаются недостаточно изученными.

Цель исследования: установить особенности хронического воспаления и атрофии слизистой оболочки желудка у больных раком желудка кишечного типа с учетом носительства полиморфных аллелей генов цитокинов, регулирующих воспаление.

Задачи исследования: 1) Оценить особенности воспалительного инфильтрата и атрофию в параканкрозной и дистантной зонах СОЖ у больных РЖКТ и раком желудка диффузного типа (РЖДТ).

2) Сопоставить особенности воспалительного инфильтрата СОЖ с носительством полиморфных аллелей генов цитокинов, регулирующих воспаление, у больных РЖКТ.

3) Изучить особенности атрофических изменений в СОЖ с учетом носительства полиморфных аллелей генов цитокинов, регулирующих воспаление, у больных РЖКТ.

Материалы и методы исследования. Было выполнено когортное одномоментное сравнительное контролируемое исследование. В исследуемую группу были включены 82 больных РЖКТ, в группу сравнения - 34 больных РЖДТ. В группах проводилось гистологические, иммуногистохимические исследование. Дополнительно в первой группе проводилось генетическое исследование. Контрольная группа включала 104 здоровых донора и была сформирована для оценки частот полиморфных аллелей генов цитокинов в исследуемой популяции. Объектом исследования был операционный материал резецированного желудка. Забор фрагментов СОЖ проводили в соответствии с требованиями Международной классификации хронического гастрита OLGA [5] (дистантная зона СОЖ). Дополнительно забирался фрагмент опухоли и СОЖ, расположенной на границе с опухолью (параканкрозная зона). Для оценки атрофии и выраженности воспаления в СОЖ использовали таблицы Российского пересмотра международной классификации хронического гастрита OLGA [6]. Иммуногистохимическое исследование выполняли с использованием первичных ready to use мышиных моноклональных антитела к CD4 (клон - 1F6), CD8 (клон - 144B), CD138 (клон - MI15) («DAKO», Дания), CD20 (клон - L26), CD68 (клон - KP1) («Diagnostic Biosystems», США) и кроличьих поликлональных антитела к IgA, IgGDAKO», Дания) с системой визуализации «Histofine». Подсчет клеток в собственной пластинке СОЖ проводился на 1000 клеток, вычислялось процентное их соотношение.

Для определения полиморфных локусов C+3953T, C-511T гена IL-1β и VNTR-полиморфизма во 2 интроне гена IL-1RN в лейкоцитах периферической крови применяли метод полимеразной цепной реакции с использованием наборов ИХБФМ СО РАН (г.Новосибирск), полиморфных локусов G-308A гена TNF-α и G-1082A гена IL-10 - наборы «SNP-экспресс» (НПФ «Литех», Россия).

Для статистического анализа достоверности различий использовались критерии: хи-квадрат (χ2), Манна – Уитни (U), Краскела-Уоллеса (H). Оценку соответствия частот аллелей закону Харди-Вайнберга проводили на он-лайн калькуляторе: http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl.

Результаты исследования и их обсуждение. Было показано, что уровень воспаления в СОЖ, оцененный как степень хронического гастрита у больных РЖКТ, коррелирует с количеством исследуемых полиморфных аллелей, носителем которых является данный больной (R=0,66, p=0,03). Обнаруженная корреляция, вероятно, связана с функциональной ролью в регуляции хронического воспаления в СОЖ исследуемых полиморфных аллелей. [4]. Предполагается, что носительство этих полиморфных аллелей приводит к повышенной продукции цитокинов как на начальных этапах воспаления, так и при персистенции воспалительного инфильтрата в СОЖ [7]. У носителей данных аллелей наблюдается выраженный провоспалительный ответ [4], что является важным фактором прогрессирования каскада P.Correa [2].

В дальнейшем, больные РЖКТ были разделены на две подгруппы. Включение больного в подгруппу носителей «провоспалительного» генотипа указывало на преобладание в его генотипе исследуемых полиморфных аллелей генов цитокинов, как в гомозиготном, так и гетерозиготном состоянии (т.е. наличие 3 и более аллелей). Носители менее 3 исследуемых полиморфных аллелей были включены в подгруппу с «нормальным» генотипом. Правомерность такого подхода была показана E.M. El-Omar и соавторами, обнаруживших повышенный риск развития рака желудка у носителей 3-4 полиморфных аллелей генов цитокинов и применивших к подобным комбинациям аллелей дефиницию «провоспалительны генотип» [8]. В результате, при оценке состава воспалительного инфильтрата собственной пластинки СОЖ у больных РЖКТ нами было обнаружено, что в подгруппе больных с «провоспалительным» генотипом наблюдается достоверно более выраженная инфильтрация СОЖ CD20+ клетками (p=0,03). При этом доля CD20+ клеток в собственной пластинке СОЖ коррелирует с показателем градации воспаления в антральном отделе и теле желудка, оцененным по Международной классификации хронического гастрита OLGA (R=0,88, p=0,000… и R=0,083, p=0,000…, соответственно). A.Kotłowska-Kmieć et al. было показано, что количество CD20+ лимфоцитов в собственной пластинке СОЖ тесно ассоциировано с H.pylori-инфекцией и коррелирует с выраженностью морфологических проявлений гастрита у детей, значительно снижаясь при эрадикации инфекта [9]. Однако хроническое воспаление и развитие атрофии в более позднем возрасте в большом проценте случаев способствуют спонтанной эрадикации инфекта. Несмотря на это, инфильтрация СОЖ CD20+ лимфоцитами сохраняется, что, по-видимому, обусловленно теми же механизмами, что и развитие эксхеликобактерного гастрита у детей [10]. Таким образом, увеличение доли CD20+ клеток, при более выраженной градации воспаления в собственной пластинке СОЖ у больных РЖКТ может указывать на длительность течения воспалительной реакции, регулируемой носительством «провоспалительного» генотипа.

Иммуногистохимическая оценка состава воспалительного инфильтрата в параканкрозной и дистантной зонах СОЖ показала, что у больных РЖКТ наблюдалась достоверно более выраженная инфильтрация CD20+ лимфоцитами собственной пластинки дистантной зоны СОЖ, в сравнении с параканкрозной зоной (p=0,000…). При этом количество CD20+ лимфоцитов находилось в положительной корреляционной связи с количеством плазматических клеток (CD138+) в собственной пластинке СОЖ (R=0,79, p=0,000…). Данная находка указывает на уже состоявшуюся реализацию хронического воспалительного ответа. При этом параканкрозная зона СОЖ, также как и в случае с CD20+ клетками, характеризовалась низкой плотностью плазмоцитарной инфильтрации. Эти результаты согласуются с данными, полученными И.А. Даниловой и Н.М. Аничковым, указывающими на уменьшение плотности плазмоцитарной инфильтрации параканкрозной зоны СОЖ у больных РЖКТ, происходящей параллельно с ростом опухоли и ее инвазией [11].

Аналогичные закономерности различия дистантной и параканрозной зон были получены и при оценке выраженности инфильтрации СОЖ IgA+ и IgG+плазмоцитами. В дистантной зоне СОЖ наблюдалась достоверно более выраженная инфильтрация IgA+ плазмоцитами, в сравнении с параканкрозной зоной (p=0,03). Кроме того в данной зоне встречались с большей частотой и IgG+ плазмоциты (p=0,000…). Дистантная зона СОЖ также характеризовалась большим значением соотношения IgG+/IgA+ плазмоцитов (0,39 против 0,18; p=0,032). Похожие результаты были показаны с помощью метода проточной цитометрии [12]. Следует обратить внимание на тот факт, что воспалительный ответ, протекающий по Th2 типу, традиционно рассматривался как ассоциированный с низким риском развития РЖКТ. [13]. В данном случае иммунный ответ по Th2 типу, наоборот, ассоциирован с РЖКТ. Вероятно, что принципиальной особенностью данного ответа, развивающегося по Th2 типу, является преключение синтеза IgA в плазмоцитах СОЖ на синтез IgG. При этом процесс переключения синтеза IgA/IgG плазматическими клетками как стереотипная реакция, развивающаяся при хроническом воспалении в слизистых оболочках, был описан А.В. Кононовым, обнаружившим нарастание продукции IgG в СОЖ, происходящее параллельно с эволюцией хронического гастрита от поверхностного до атрофического [14]. Появление синтеза IgG приводит к изменению особенностей воспалительной реакции в СОЖ. В отличие от IgA, связывание IgG с антигенами H.pylori приводит к активации системы комплемента и аттракции нейтрофильных лейкоцитов [15]. Дальнейший механизм канцерогенеза обусловлен токсическим воздействием на эпителиоциты СОЖ активных форм кислорода и азота, продуцируемых нейтрофильными лейкоцитами.

При оценке параканкрозной зоны нами была обнаружена достоверно более выраженная инфильтрация собственной пластинки СОЖ CD8+ лимфоцитами и CD68+ макрофагами (p=0,02 и p=0,000…, соответственно). Увеличение плотности макрофагальной инфильтрации [16] и количества цитотоксических Т-лимфоцитов в параканкрозной зоне СОЖ при РЖКТ было показано другими исследовательскими группами [17]. Инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки желудка CD8+ и CD68+ клетками, вероятно, является морфологическим проявлением неспецифических факторов защиты и иммунного ответа Th-1 типа, возникающего в ответ на развитие опухоли [18].

На основании полученных результатов оценки особенностей воспалительного инфильтрата в параканкрозной и дистантной зонах СОЖ с учетом носительства полиморфных аллелей генов цитокинов была составлена схема регуляции воспаления при

РЖКТ, отображенная на рисунке 1. На данной схеме разграничены дистантная и параканкрозная зоны СОЖ, что связано с поляризацией иммунного ответа по Th2 типу в дистантной зоне и по Th1 типу в параканкрозной зоне. В дистантной зоне СОЖ проявлением иммунного ответа, протекающего по Th2 типу, является выраженная инфильтрация СОЖ CD20+ лимфоцитами, в свою очередь, обусловливающая выраженную инфильтрацию СОЖ плазмоцитами (CD138+). Подобные особенности

Рис. 1. Регуляция воспаления в СОЖ при РЖКТ.


воспалительного инфильтрата дистантной зоны СОЖ, вероятно, отражают уже состоявшуюся реализацию хронического воспалительного ответа, еще одним проявлением которой является переключение синтеза плазматическими клетками с IgA на IgG [14]. Иммунные реакции, протекающие с участием IgG, приводят к активации системы комплемента и аттракции нейтрофильных лейкоцитов и моноцитов [15]. Возможно, что этой последовательностью клеточных взаимодействий объясняется обнаруженная нами корреляция между выраженностью инфильтрации CD20+ клетками собственной пластинки СОЖ и показателем градации воспаления в антральном отделе и теле желудка, оцененным по классификации OLGA. Вероятно, что обнаруженная поляризация является лишь закономерным финальным этапом эволюции хронического гастрита и, в действительности, развитию описанного иммунного ответа предшествовала его поляризация по Th1 типу, обусловившая в участках наибольшей выраженности развитие неоплазии. Тогда как стимуляция Th2 типа иммунного ответа, обнаруженная к моменту исследования, связана с истощением Th1 типа иммунного ответа дистантной зоны СОЖ и миграцией эффекторных клеток в зону опухоли и параканкрозную зону. Последним обстоятельством обусловлено обнаружение выраженной CD8+ и CD68+ инфильтрации параканкрозной зоны СОЖ. Также на данную схему нанесены особенности регуляции воспаления. Вопреки ожидаемым результатам, нам не удалось показать роль носительства отдельных полиморфных аллелей в регуляции воспаления в дистантной зоне СОЖ. Однако была показана роль «провоспалительного» генотипа, определявшего не только выраженность воспалительного инфильтрата, но и выраженную инфильтрацию СОЖ CD20+ клетками, которая может рассматриваться как косвенный маркер, отражающий роль данного генотипа в развитии хронического воспаления в собственной пластинке СОЖ.

При РЖДТ различия состава воспалительного инфильтрата между параканкрозной и дистантной зоной СОЖ отстутствовали, что, вероятно, связано с принципиально иным механизмом канцерогенеза, не носящем стадийного характера и не связанным с развитием хронического воспаления в СОЖ [19].

Нами также оценивались атрофические изменения СОЖ. У больных РЖКТ преобладал атрофический пангастрит, соответствующий стадиям III и IV. Подобные изменения в СОЖ обнаруживались у 76,8% больных. Аналогичную распространенность стадий III и IV хронического гастрита показали K. Satoh и др. на японской популяции [20]. У больных РЖДТ атрофические изменения СОЖ отсутствовали или были выражены слабо (стадии I-II хронического гастрита) - в 21,4%, 39,3% и 39,3%, случаев соответственно. Обнаруженные между группами различия объяснимы с позиций механизмов канцерогенеза в СОЖ. Стадийность процесса канцерогенеза при РЖКТ приводит к тому, что атрофические изменения СОЖ постепенно становятся более выраженными и на стадии III-IV хронического гастрита сопровождаются появлением неоплазии. При РЖДТ изменения в СОЖ не носят стадийный характер [19].

У больных РЖКТ было обнаружено наличие ассоциации атрофических изменений СОЖ, соответствующих стадии IV хронического гастрита с носительством полиморфного аллеля -511Т и генотипа -511 T/Т гена IL-1β (носительство данного аллеля и генотипа достоверно чаще встречалось у больных, атрофические изменения СОЖ которых соответствовали стадии IV, p=0,04). Наличие стадии IV хронического гастрита соответствует максимально выраженным атрофическим изменениям и фактически является заключительным этапом каскада P.Correa [2], предшествующим развитию неоплазии или продолжающимся параллельно с ее развитием. Однако наличие РЖКТ возможно уже на стадии III [20]. Как правило, резекция желудка проводится на максимально ранних сроках с момента диагностики РЖКТ, соответственно у больных не успевают развиться атрофические изменения, соответствующие стадии IV хронического гастрита. Однако носительство провоспалительного аллеля -511Т гена IL-1β, ассоциированное с повышенной продукцией IL-1β [7], вероятно, обусловливает выраженные провоспалительные эффекты цитокина [8], что способствует ускоренной прогрессии каскада P.Correa. В результате, развитие атрофических изменений в СОЖ происходит быстрее и, следовательно, к моменту появления неоплазии успевают развиться атрофические изменения, соответствующие стадии IV хронического гастрита. Обнаружение стадии IV хронического гастрита также было ассоциировано с носительством полиморфного аллеля -1082A и генотипа -1082A/A гена IL-10 у больных РЖКТ (носительство данного аллеля и генотипа достоверно чаще встречалось у больных, атрофические изменения СОЖ которых соответствовали стадии IV, p=0,025). Биологические эффекты IL-10, способствуют подавлению продукции цитокинов, регулирующих поляризацию иммунного ответа по Th-1 типу [21]. Учитывая функциональную роль однонуклеотидной замены G-1082A в гене IL-10 [7], можно предположить, что у носителей генотипа -1082A/A и аллеля -1082A снижен эффект подавления Th-1 иммунного ответа. В свою очередь поляризация иммунного ответа по Th-1 типу приводит к развитию выраженных атрофических изменений [22].


Выводы:

1)При РЖКТ имеются различия между параканкрозной и дистантной зонами СОЖ, характеризующиеся выраженной инфильтрацией дистантной зоны собственной пластинки СОЖ плазматическими клетками, продуцирующими IgG, находящейся в прямой корреляционной зависимости с выраженностью инфильтрации CD20+ лимфоцитами. Параканкрозная зона характеризуется выраженной инфильтрацией CD8+ лимфоцитами и CD68+ макрофагами. При РЖДТ различия между дистантной и параканкрозной зонами СОЖ отсутствуют.

2) Атрофические изменения параканкрозной и дистантной зон СОЖ у больных РЖКТ, носят выраженный характер и соответствуют стадиям III и IV хронического гастрита, у больных РЖДТ - отсутствуют или выражены слабо (стадии I и II хронического гастрита).

3) Показатель степени хронического гастрита у больных РЖКТ находятся в положительной корреляционной связи с количеством полиморфных аллелей генов C+3953T и C-511T IL-1β, VNTR в интроне 2 IL-1RN, G-1082A IL-10, G-308A TNF-α.

4) Выраженный мононуклеарный инфильтрат собственной пластинки слизистой оболочки желудка с высокой долей CD20+ лимфоцитов (степень 3 и 4 хронического гастрита) ассоциирован с носительством 3 и более полиморфных аллелей генов C+3953T и C-511T IL-1β, VNTR в интроне 2 IL-1RN, G-1082A IL-10, G-308A TNF-α у больных РЖКТ.

5) Наличие стадии IV хронического гастрита у больных РЖКТ, ассоциировано с носительством полиморфного аллеля -511Т и генотипа -511 T/Т гена IL-1β; полиморфного аллеля -1082A и генотипа -1082A/A гена IL-10.



Литература:

  1. Konturek P.C. Helicobacter pylori infection in gastric cancerogenesis / P.C. Konturek, S.J. Konturek, T. Brzozowski // Journal of physiology and pharmacology. – 2009. – Vol. 60, № 3. – P. 3-21.

  2. Correa P. Carcinogenesis of Helicobacter pylori / P.Correa, J. Houghton // Gastroenterology. – 2007. – Vol.133, №2. – P.659-672.

  3. Interleukin-1 polymorphisms associated with increased risk of gastric cancer/ E. M. El-Omar [et al.] // Nature. – 2000. – Vol. 404. – P.398-402.

  4. Shanks A.M. Helicobacter pylori infection, host genetics and gastric cancer / A.M. Shanks , E.M. El-Omar // Journal of digestive diseases. – 2009. – Vol.10, №3. – P.157-164.

  5. OLGA staging for gastritis: A tutorial / M. Rugge [et al.] // Digestive and liver disease. – 2008. – Vol.40, №8. – P.650-658.

  6. Аруин Л.И. Атрофический гастрит: проблемы обоснования морфологического диагноза (материалы к пересмотру международных классификаций - OLGA и Atrophy Club / Л.И. Аруин, А.В. Кононов, С.И. Мозговой // Актуальные вопросы патологической анатомии: Материалы III съезда Российского общества патологоанатомов. – Самара, 2009. – № 1. – С. 5-8.

  7. Smith A.J. Cytokine and cytokine receptor gene polymorphisms and their functionality / A.J. Smith , S.E. Humphries // Cytokine & growth factor reviews. – 2009. – Vol.20, №1. – P.43-59.

  8. Increased risk of noncardia gastric cancer associated with proinflammatory cytokine gene polymorphisms. / E.M. El-Omar [et al.] //. Gastroenterology. – 2003. – Vol. 124, №5. – P.1193-1201.

  9. Evaluation of selected immunocompetent cells expression in gastric mucosa in children with Helicobacter pylori infection before and after eradication treatment- a preliminary study / A. Kotłowska-Kmieć [et al] // Med Wieku Rozwoj. – 2007. – Vol. 11, № 4. – P.393-399.

  10. Кононов А.В. Helicobacter pylori – инфекция: генотип хозяина – фенотип гастрита / А.В. Кононов, Е.Г. Поморгайло, Е.А. Потрохова и др. // Материалы III съезда Российского общества патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии». – Самара, 2009. – С. 29-30

  11. Данилова И. А. Паренхиматозно-стромальные взаимоотношения при раке желудка кишечного типа / И. А. Данилова, Н. М. Аничков // Архив патологии. - 2011. - Т. 73, N 3. - С. 31-34.

  12. Decreased IgA antibody production in the stomach of gastric adenocarcinoma patients. / M. Quiding-Järbrink[et al.] //Clin Immunol. – 2009. – Vol. 131, № 3. – P.463-471.

  13. Intestinal helminthiasis in Colombian children promotes a Th2 response to Helicobacter pylori: possible implications for gastric carcinogenesis. / M.T. Whary [et al.] // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. – 2005. – Vol. 14, № 6. – P.1464-1469.

  14. Кононов А.В. Местный иммунитет и регенерация слизистых оболочек при хроническом воспалении (биопсийное исследование). Омск. 1993; С. 127-158.

  15. Brandtzaeg P. Update on mucosal immunoglobulin A in gastrointestinal disease. / P. Brandtzaeg // Curr Opin Gastroenterol. – 2010. – Vol.26, №6. – P.554-563.

  16. Association of Intra-tumoral Infiltrating Macrophages and Regulatory T Cells Is an Independent Prognostic Factor in Gastric Cancer after Radical Resection / B. Wang [et al.] // Annals of surgical oncology. – 2011. – Vol.18, №9. – P.2585-2593.

  17. Intratumoral expression of IL-17 and its prognostic role in gastric adenocarcinoma patients. / J.G. Chen [et al.] //Int J Biol Sci. – 2011. – Vol. 7, № 1. – P.53-60.

  18. Бережная Н. М. Иммунология злокачественного роста / Н. М. Бережная, В. М. Чехун. — Киев: Наукова думка, 2005. – 791с.

  19. Vauhkonen M. Pathology and molecular biology of gastric cancer / M. Vauhkonen, H. Vauhkonen, P. Sipponen // Best Prac & Res Clin Gastroenterol. – 2006. – Vol. 20, № 4. – P.651–674.

  20. Assessment of Atrophic Gastritis Using the OLGA System / K. Satoh [et al.] // Helicobacter. – 2008. – Vol.13, №3. – P.225-229.

  21. Белоцкий С.М. Воспаление и иммунный ответ в таблицах и рисунках. / С.М. Белоцкий, Р.Р. Авталион. – М. : Гончаръ, 2006. – 63 с.

  22. Fox G.J. Inflammation, atrophy, and gastric cancer. / G.J. Fox, T.C. Wang.// J Clin Invest. – 2007. – Vol.117, №1. – P.60-69.

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle