Экология Арктики: растения и их фунгицидная активность

 

Растительный покров – важнейший компонент полярных экосистем при прогнозировании экологических последствий промышленного освоения Российской Арктики. Работа посвящена изучению способности различных растений Арктического региона подавлять рост грибковой микрофлоры. На основании оценки активности синтеза углекислого газа, изменений рН-среды и динамики количества дрожжевых клеток при брожении в отварах растений установлено, что ягель, сфагнум и багульник проявляют фунгистатические свойства. Наилучшей фунгицидной активностью обладает шикша (водяника), что обусловлено активностью её биологических веществ, способных блокировать ферменты и замедлять обмен веществ в микроорганизмах. В связи с чем, сделан вывод о возможности ее использования в качестве сырья местной флоры при изготовлении функциональных продуктов питания, создаваемых для нормализации деятельности желудочно-кишечного тракта у населения региона. Выполнение работы позволило автору не только усовершенствовать навыки исследовательской работы и проведения её экспериментальной части, но и приобщится к детальному изучению проблем естественно-ориентированной, природоохранной направленности и формированию экологической культуры.

Ключевые слова: растения Арктического региона, фунгицидная активность.

 

Введение: Прогноз экологических последствий промышленного освоения Российской Арктики невозможен без изучения особенностей растительного покрова – важнейшего компонента полярных экосистем, поддерживающего термический режим многолетнемерзлых пород и обеспечивающего их стабильность. Малая видовая насыщенность флоры здесь компенсируется многообразием биотопов, изменяющихся под действием экзогенных геоморфологических процессов. Фитоценозы Ямальского Севера эволюционно молоды и нестабильны, поэтому имеют низкую устойчивость к техногенному воздействию, что может отразиться не только на структурно-динамических характеристиках самих экосистем, но и на качестве местного растительного сырья, снижая активность биологических веществ растений, обесценивая полезные и лечебные фитотерапевтические свойства – важные для потребителей – жителей региона. Поэтому комплексные исследования экологической и медико-биологической направленности в последнее время являются наиболее актуальными.

Цель работы – оценить фунгицидную активность растений Арктического региона в отношении дрожжевых форм – сахаромицетов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Проанализировать активность синтеза углекислого газа при выращивании культуры сахаромицетов с добавлением отваров ягеля, сфагнума, шикши и багульника.
2. Определить значения рН-среды при протекании процессов брожения с добавлением отваров анализируемых растений.
3. Сравнить динамику количества дрожжевых клеток в исследуемых отварах растений и контрольном опыте.
4. Оценить способность растений подавлять деятельность грибковой микрофлоры и обосновать их практическое применение.

Материалы и методы

Специфика поставленных задач потребовала применения целого комплекса методов: наблюдения, сравнения, обобщения, библиографического, рН-метрии, микроскопии, математической статистики с использованием программы «Biostat».

Объектом для исследования стали заготовленные в летний период следующие растения: лишайник ягель (Cladonia rangiferina), мох сфагнум (Sphágnum palustre), шикша (Empetrum nigrum) и багульник (Lédum palústre), произрастающие в окрестностях города Надыма (ЯНАО). Остановимся на краткой характеристике каждого растения.

Ягель представляет собой кустистый лишайник из рода Кладония. Слоевище, состоит из мелких пепельно-серых бугорков. Подеции высотой до 20 см, диаметром до 2 мм, пепельно- или коричневато-серые, густо-разветвлённые. Внешняя сердцевина паутинисто-войлочная, в базальной части с зеленоватыми бугорками. Апотеции мелкие, коричневые, расположены на концах веточек. Встречается в лесотундре с умеренным снежным покровом, на торфяных болотах [7]. Согласно литературным данным, ягель может служить источником биогенных элементов – особенно Ca, Mg, P, K и Na, а также содержит в своем составе различные кислоты [8]. Обладает противовоспалительным, обезболивающим и цитотоксическим действием [9].

Сфагнум – род мхов, обычных обитателей верховых и переходных болот. Растения нарастают верхней частью, а снизу отмирают. Сфагнум впитывает воду всем телом [7]; ризоидов нет. Для него характерны особые водозапасающие клетки на листьях и стебле (прозрачные, мёртвые, полые с отверстиями); клеточная стенка укреплена утолщениями. Водозапасающие клетки окружены более мелкими зелёными фотосинтезирующими клетками, которые объединены в единую сеть. Имеются ножка и коробочка со спорами. Аминокислоты сфагнума представлены аргинином, гистидином, лизином, глютаминовой кислотой, аланином, триптофаном [2]. Отмечены бактерицидные свойства сфагнума.

Шикша или водяника – род вечнозелёных низкорослых кустарничков семейства Вересковые с листьями, похожими на хвоинки, и невзрачными цветками [6]. Типичные места обитания растения – сфагновые болота, мохово-лишайниковые и каменистые тундры, хвойные леса, где часто образует сплошной покров. Высота около 20 см, а длина побегов до 100 см. Стебель тёмно-бурого цвета, плотно покрыт листьями. Цветки пазушные, с двойным актиноморфным околоцветником, с тремя розовыми или пурпурными лепестками и тремя чашелистиками. Плод – чёрная (с сизым налётом) ягода диаметром до 5 мм с жёсткой кожицей и твёрдыми семенами. Подобно некоторым другим представителям семейства вересковых, водяника не может обходиться без симбиоза с грибами: от них она получает некоторые минеральные вещества, взамен снабжая их продуктами фотосинтеза [5]. Водяника содержит углеводы, тритерпеноиды, тритерпеновые сапонины, кумарины, дубильные вещества, флавоноиды (кверцетин, кемпферол, рутин), жирное масло, воск, алкалоиды, витамин С, каротин, кислоты (урсоловую, бензойную, уксусную и фенолкарбоновую), а также микроэлементы: Mn, Ba, Ag, Mg [1].

Багульник – растение семейства Вересковые. Растёт на моховых болотах, торфяниках, в заболоченных хвойных лесах. Прямостоячий вечнозелёный кустарник высотой 60 см. Стебли лежачие, укореняющиеся. Кора старых ветвей голая, серовато-бурая. Листья очередные, короткочерешковые, кожистые, сверху блестящие, снизу буровойлочные. Цветки белые с сильным запахом на длинных тонких железистых цветоножках. Плод – продолговатая многосемянная коробочка длиной до 8 мм. Медонос. Мёд пригоден в пищу только после кипячения. Ядовит [6]. Некоторыми исследователями в эфирном масле багульника обнаружены арбутин, дубильные вещества, флавоноиды, а общее количество веществ может превышать более 200 компонентов. Багульник обладает фитонцидной активностью, применяется при заболеваниях легких, для лечения ринитов и гриппа [3].

В качестве экспериментального материала выбраны сахаромицеты – класс сумчатых грибов (аскомицетов), которые доступные в свободной продаже как сухие быстродействующие пекарские дрожжи (фирмы Саф-момент). Вегетативное тело представляет собой отдельные почкующиеся клетки [4]. Могут вызывать спиртовое брожение сахаров (в анаэробных условиях) или их окисление. Сбраживают глюкозу, другие моно- и олигосахариды. Для дрожжей характерен и аэробный (дыхательный) метаболизм, поэтому при доступе воздуха углеводы не сбраживаются до спирта, а окисляются.

Для проведения опытной части работы необходимо следующее оборудование:

                    Сухие образцы анализируемых растений, дрожжи, сахар, вода.

                    Весы аналитические, водный термометр, рН-метр, микроскоп, секундомер.

                    Термос (500 мл), медицинские капельницы (2 шт.), шприц (10 мл), «водяная баня», пробирки (15 шт.), мерный стакан (250 мл), бинт для фильтрования, ножницы, сантиметровая лента.

Собираем конструкцию для проведения опыта. В крышке термоса проделываем 2 отверстия диаметром 4 мм. От медицинских капельниц отрезаем две трубки 150 см и 30 см. Продеваем их в отверстия следующим образом: короткий конец первой трубки закрепляем в крышке без погружения, а длинный – сначала опускаем вниз по наружной стенке термоса, а потом поднимаем вверх на максимальную высоту и фиксируем, совместив с градацией сантиметровой ленты; длинный конец второй трубки опускаем на дно термоса, а противоположный – заглушаем, вставив шприц. В первую трубку наливаем 0,5 мл воды и перемещаем её в нижний изгиб. Это своего рода «водяной манометр» для определения активности синтеза СО₂ при брожении, измеряемой в условных единицах (см водного столба). Вторая трубка предназначена для отбора проб и дальнейших измерений рН-среды и подсчета количества дрожжевых клеток.

Последовательность проведения опыта:

1. Взвешиваем образцы растений (20 г), дрожжей (0,5 г), сахара (20 г).
2. Мерным стаканом отмеряем 250 мл воды.
3. Готовим отвар растения из расчета 20 г сырья и 250 мл воды при экстрагировании на водяной бане в течение 30 минут.
4. Отвар фильтруем, доводим объем до 200 мл и охлаждаем до 40^оС.
5. В отваре растворяем сахар, добавляем дрожжи, полученное содержимое наливаем в термос и закрываем крышкой.
6. Проводим эксперимент, фиксируем результаты. Производим отбор проб.
7. Аналогично повторяем последовательность п. 1-6 с другими образцами растений и контрольный опыт с водой.

Суть эксперимента заключается в том, что в термосе при анаэробных условиях происходит процесс брожения – результат жизнедеятельности дрожжей. В результате химической реакции брожения, осуществляемой дрожжами, одна молекула глюкозы преобразуется в 2 молекулы этанола и 2 молекулы углекислого газа.

C₆Н₁₂О₆ → 2С₂Н₅ОН + 2СО₂

Углекислый газ, поступая по длинной трубке, поднимает вверх «водяную пробку». Можно предположить, что чем интенсивнее идет процесс брожения, тем выше способна подниматься обозначенная «метка» и тем выше скорость её подъёма.

Результаты и обсуждение:

В ходе проведения контрольного опыта по оценке активности синтеза углекислого газа при выращивании культуры сахаромицетов было установлено, что процесс брожения без добавления отваров растений протекал достаточно равномерно и потребовалось 23 минуты для достижения высоты 100 см (рис. 1). Выделение углекислого газа при брожении с отваром ягеля происходило несколько медленнее, преодолев 100-сантиметровую отметку за 40 минут. В опытах с остальными растениями метровый рубеж не был преодолен. Максимально «водная пробка» поднялась на 55 см при опыте со сфагнумом и на 34 см – с шикшей. Наилучшей способностью подавления активности сахаромицетов отличился багульник, высота водного столба при этом так и не поднялась выше 5 см за весь период наблюдения.

Рис. 1. Динамика активности метаболизма сахаромицетов по показателю высоты водного столба (см)

 

На основании проведенного опыта можно предположить, что отвар ягеля способен лишь незначительно подавлять рост дрожжевых клеток. Однако, математическая обработка результатов позволила установить достоверное снижение активности метаболизма сахаромицетов и увеличения фунгицидной активности в отношении сфагнума (р<0,05), шикши (р<0,05) и багульника (р<0,005) по сравнению с контролем. Следует отметить, что только лишь по одному условному показателю делать общий вывод о фунгицидной способности анализируемых растений не представляется возможным. Проанализируем динамику водородного показателя при брожении в разных отварах растений.

Определение водородного показателя осуществлялось при помощи рН-датчика с выведением результатов в виде графических материалов на монитор компьютера. Анализ изменения уровня рН-показателя определил, что процессы брожения проходят в условиях кислой среды (рис. 2). В контрольном опыте наблюдалось снижение показателя с 5,2 до 3,1 усл. ед., а в опытах с ягелем и сфагнумом с 4,9 до 4,2 усл. ед. В опыте с шикшей и багульником уровень рН-среды остался без изменений на уровне 4,6 усл. ед.

Рис. 2. Динамика водородного показателя в отварах растений

 

На начальной стадии брожения, осуществляемого дрожжами, пируват расщепляется на этанол и диоксид углерода. Известно, что у грибов пировиноградная кислота подвергается анаэробному расщеплению с образованием этанола в процессе ферментации. Наиболее очевидно процесс брожения протекал в контрольном опыте с образованием конечных продуктов метаболизма и запасанием энергии (в форме АТФ и НАДH). Незначительное изменение водородного показателя в опытах при равных температурных условиях с отварами растений по сравнению с контролем демонстрирует сдерживание процессов брожения, а растения выступают своеобразными ингибиторами.

Корреляционный анализ выявил наличие сильной обратной связи (r=-0,91, при р<0,01) при сравнении активности синтеза углекислого газа в процессе выращивания культуры сахаромицетов и изменений уровня рН в контрольном опыте. В остальных случаях достоверных различий не установлено.

Известно, что дрожжи-грибы представляют собой одноклеточные неподвижные организмы, поэтому их с легкостью можно увидеть под микроскопом и посчитать. Предварительно пробы с содержимым, отобранные от разных опытов через определенные интервалы времени, были заморожены в медицинских пробирках. Для подсчета клеток дрожжей по методу Нечипоренко был использован микроскоп ЛОМО Микмед 6 (Россия) и камера Горяева. Под микроскопом (при увеличении в 400 раз) зафиксировано множество овальных и продолговатых клеток, которые располагаются отдельно или соединены в цепочки, иногда ветвящиеся. Подсчет осуществлялся через определенные временные промежутки. Рисунок 3 демонстрирует рост количества дрожжевых клеток в контрольном опыте на разных стадиях эксперимента: 1 – начальная; 2 – через 50-минутный интервал; 3 – окончательная (через сутки).

1 стадия	2 стадия	3 стадия
Рис. 3. Рост количества дрожжевых клеток на разных стадиях эксперимента

 

Подсчет количества дрожжевых клеток в начале опыта и по истечению суток показал, что в контрольном опыте произошел их рост в более чем 2 раза (рис. 4). Менее выраженное увеличение наблюдалось в опыте с ягелем (с 2850х10³ по 5500х10³ шт./мл) и сфагнумом (с 3000х10³ по 5150х10³ шт./мл). Количество дрожжевых клеток с отваром багульника увеличилось незначительно (с 3000х10³ по 3300х10³ шт./мл), но достоверно отличалось (р<0,05) по сравнению с контролем, а в отваре шикши произошло достоверное (р<0,005) уменьшение количества дрожжевых клеток.

Рис. 4. Динамика количества дрожжевых клеток (х10³ шт./мл) во времени

 

Корреляционный анализ позволил установить существование прямой сильной связи между активностью синтеза углекислого газа при выращивании культуры сахаромицетов и ростом количества дрожжевых клеток в опытах с ягелем (r=0,874, при р<0,05) и контролем (r=0,869, при р<0,05), а также обратной связи средней силы – в опыте с шикшей (r=–0,507).

Таким образом, установлено, что такие растения Арктического региона как ягель, сфагнум и багульник полностью не подавляют рост дрожжевой микрофлоры и обеспечивают так называемый фунгистатический эффект, в то время как отвар шикши способен не только сдерживать процессы брожения, но и проявлять выраженные фунгицидные свойства. Возможно, это связано с тем, что растения водяники содержат в своем составе бензойную кислоту, способную блокировать ферменты и замедлять обмен веществ во многих одноклеточных микроорганизмах, включая и грибковую микрофлору.

По нашим данным, ценность любого научного исследования заключается в возможности практического применения результатов работы. Так, наиболее очевидной областью использования способности шикши подавлять рост грибковой микрофлоры, мы считаем, фитотерапевтическое направление в медицине. Грибковый дисбаланс и процессы активного брожения в кишечнике человека связанны с чрезмерным употреблением простых углеводов, привнесением в пищевой рацион консервантов, лечением антибиотиками и пр. В последнее время обозначенные проблемы наиболее очевидны для жителей Ямальского Севера, так как здесь культуру здорового питания подрывают большое количество импортных продуктов, фастфуд, возможность самолечения по интернету и многое другое. Возможный путь решения обозначенной проблемы это употребление функциональных продуктов питания, изготовленных на основе отвара травы или ягод шикши в виде, например, мармелада или киселя.

Другим перспективным направлением использования результатов работы может стать борьба с грибковыми заболеваниями растений в сельском или лесном хозяйствах. Известно, что сельскохозяйственные и декоративные растения зачастую страдают различными заболеваниями, из которых на грибковые приходиться до 80%. А это еще один повод подумать о использовании фунгицидных свойств водяники при проведении агротехнических мероприятий.

Мы считаем, что значение шикши жителями Ямальского Севера недооценено, так как массового сбора и своего применения в качестве заготавливаемого сырья из дикоросов местной флоры данная ягодная культура не находит. Всё большее использование обнаруживают такие благородные ягоды, как брусника, клюква, морошка, голубика и черника. Получив уникальные данные о способности шикши проявлять фунгицидные свойства, мы обратили внимание на типичные места распространения растения – это полигональные, бугристые и сфагновые болота, мохово-лишайниковые и каменистые тундры и хвойные (обычно сосновые) леса. В связи с тем, что ареал произрастания водяники по территории нашей страны очень широк, то можно предположить, что результаты исследования могут выходить далеко за рамки регионального уровня.

 

Выводы

1.      Сравнение активности синтеза углекислого газа при деятельности культуры сахаромицетов позволило установить, что процессы брожения достоверно замедляются в отварах сфагнума (р<0,05), шикши (р<0,05) и багульника (р<0,005) по сравнению с контрольным опытом.
2.      Протекание процесса брожения в контрольном опыте проходит в условиях кислой среды, при этом значение водородного показателя снижается с 5,2 до 3,1 усл. ед. Деятельность дрожжей в отварах растений протекает в более стабильных условиях – в среднем при рН=4,6.
3.      Незначительный рост количества дрожжевых клеток в отварах ягеля, сфагнума и багульника на окончательной стадии опыта при сравнении с контролем свидетельствует о замедлении активности метаболизма сахаромицетов. Способностью подавлять рост грибковой микрофлоры отмечена шикша, так как только в ее отваре по окончании эксперимента произошло достоверное (р<0,005) уменьшение количества дрожжевых клеток по сравнению с контролем.
4.      Ягель, сфагнум и багульник обладают фунгистатическими, а шикша фунгицидными свойствами.

Заключение

На основании полученных данных установлено, что большинство из анализируемых растений Арктического региона обладают фунгистатическими свойствами. Это относится к лишайнику – ягелю, мху – сфагнуму и цветковому растению – багульнику. Однако, в связи с ядовитыми качествами последнего, его использование жителями Ямальского региона небезопасно для здоровья и может быть рекомендовано только по особому назначению врачей. По нашим данным, наилучшей фунгицидной активностью в отношении дрожжевой микрофлоры обладает шикша. Поэтому очевиден вывод о возможности использования этого растения в качестве сырья местной флоры при приготовлении функциональных продуктов питания, создаваемых для нормализации деятельности желудочно-кишечного тракта населения региона.

Автор работы выражает глубочайшую признательность и благодарность д.м.н. Лобанову А.А. (ГКУ ЯНАО Научный центр изучения Арктики, г. Надым) за научное консультирование при выполнении исследования; к.б.н. Бахтиной Е.А. (Биохимическая лаборатория МУЗ ЦРБ) за возможность проведения этапа микроскопирования.

 

Литература:

 

1. Андреева Н. В., Малогулова И. Ш. Виды шикши как перспективный источник БАВ в условиях Якутии //Мат. конф. «Современные наукоемкие технологии». 2013. № 9. С. 51.
2. Баркина Н. А., Калинкина Г. И., Фоминых Л. В. и др. Исследование аминокислотного состава Сфагнума бурого //Химия растительного сырья. 2000. № 1. С. 81.
3. Белоусова Н. И., Хан В. А., Ткачев А. В. Химический состав эфирного масла багульников //Химия растительного сырья. 1999. № 3. С. 5-38.
4. Гарибова Л. В., Лекомцева С. Н. Основы микологии. Морфология и систематика грибов и грибоподобных организмов. – М.: Товарищество научн. изд., 2005. – С. 74–75.
5. Губанов И. А. Empetrum nigrum L. – Водяника (Вороника) чёрная, или Шикша //Иллюстрированный определитель растений Средней России. – М.: Т-во науч. изд. КМК, 2003. – Т. 2.– С. 535.
6. Еленевский А. Г., Соловьёва М. П., Тихомиров В. Н. Ботаника. Систематика высших, или наземных, растений: учебник для студ. высш. пед. учебн. заведений – М.: «Академия», 2006. – С. 56.
7. Сает Ю. Е., Ревич Б. А., Янин Е. П. и др. Геохимия окружающей среды. М.: Недра, 1990. – 335 с.
8. Шербакова А. И., Коптина А. В., Канарский А. В. Биологически активные вещества лишайников //Лесной журнал. 2013. №3. С. 7-16.
9. Veriable responses of diferent human cancer cells to the lichen compounds parietin, atranorin, usnic acid and gyrophoric acid / M. Backorova //Toxicol in vitro. 2011. Р. 37–44.