Методика количественного определения суммы аминокислот в листе каштана конского обыкновенного

Введение

Основными источниками лекарственного сырья в России являются промышленные заготовки от дикорастущих и возделываемых растений, при этом значительную долю составляют закупки по импорту. Перспективным направлением увеличения заготовок отечественного сырья является расширение его сырьевой базы [2,4].

За последнее время уделялось значительное внимание изучению аминокислотного состава в лекарственном растительном сырье. Аминокислоты – органические кислоты, имеющие в своей структуре аминогруппу в α- или других положениях. Аминокислоты являются структурными компонентами белков и составной частью ферментов, витаминов и других, важных для организма органических соединений. Растения синтезируют все аминокислоты, в отличие от организма животного и человека, неспособного синтезировать некоторые из них (незаменимые аминокислоты). Дефицит незаменимых аминокислот организм человека восполняет с растительной пищей. Аминокислоты необходимы для полноценной работы головного мозга, являясь предшественниками нейромедиаторов [1,3,5].

Перспективным источником создания лекарственных препаратов на основе лекарственного сырья является каштан конский обыкновенный.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовали образцы листа каштана конского обыкновенного, собранного в парковой зоне города Москвы осенью 2010 г. Для определения суммы аминокислот в листьях была использована методика, основанная на реакции взаимодействия аминокислот с раствором нингидрина и последующем спектрофотометрировании полученного окрашенного комплекса при длине волны около 570 нм. В ходе эксперимента нами была уточнена длина волны максимума поглощения окрашенного комплекса с нингидрином глютаминовой кислоты и водного извлечения из листьев каштана.

Брали 5,0000 г (точная навеска) растительного сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещали в колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл воды дистиллированной и нагревали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение часа. Охлаждали, извлечение фильтровали через обеззоленный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Объем доводили до метки водой, перемешивали (исследуемый раствор).

Около 0,0500 г (точная навеска) кислоты глютаминовой помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 20-30 мл воды и доводили раствор водой до метки (РСО).

0,5 мл исследуемого раствора помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 1 мл 0,25% раствора натрия карбоната, 2 мл спиртового раствора нингидрина и нагревали 10 минут на кипящей водяной бане. После охлаждения раствор доводили водой до метки. Параллельно в мерную колбу вместимостью 50 мл помещали 2 мл раствора РСО кислоты глютаминовой. Оптическую плотность полученных растворов измеряли на спектрофотометре при длине волны 568 нм в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм относительно воды. Содержание суммы аминокислот в сырье в % Х, в пересчёте на кислоту глютаминовую. Рассчитывали по формуле:

Х = D* ∙ М ∙ 50 ∙ 2 ∙ 50 ∙ 100, где

D ∙ m ∙ 0,5 ∙ 100 ∙ 50 ∙ (100 - W)

D* – оптическая плотность испытуемого раствора, в нм;

D – оптическая плотность РСО глютаминовой кислоты, в нм;

М – масса РСО глютаминовой кислоты, в г;

m – масса сырья, в г;

W – потеря массы при высушивании сырья, в %.

Результаты и обсуждения

По полученным данным комплекс глютаминовой кислоты и нингидрина имеет максимум поглощения при длине волны 568±2 нм. Комплекс водного извлечения с нингидрином имеет максимум поглощения при длине волны 568,5 ±2нм (рис. 1 и 2).

Рис. 1. УФ-спектр комплекса водного раствора РСО глютаминовой кислоты с раствором нингидрина

Рис. 2. УФ-спектр комплекса водного извлечения из листьев каштана с раствором нингидрина.

С использованной разработанной методикой проанализированы образцы листа каштана конского обыкновенного и показаны в таблице 1 и 2.

Таблица 1

Результаты количественного определения суммы аминокислот в листьях каштана, в пересчёте на глютаминовую кислоту.

Таблица 2

Метрологические характеристики результатов спектрофотометрического количественного определения аминокислот, в пересчете на глютаминовую кислоту.

Согласно проведенным исследованиям, в листьях каштана конского обыкновенного, количественное содержание свободных аминокислот колеблется в пределах около 0,77%.

Достоверность предложенной методики определения суммарного содержания аминокислот подтверждена опытами с добавками кислоты глютаминовой. Результаты опытов представлены в таблице 3.

Относительная ошибка опытов с добавками находится в пределах случайной ошибки предложенной методики, что свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки методики.

Таблица 3

Результаты количественного определения аминокислот в листьях каштана с добавками

глютаминовой кислоты

Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствует о том, что ошибка единичного определения суммы аминокислот, в пересчете на глютаминовую кислоту в листе каштана конского обыкновенного с доверительной вероятностью 95%, составляет ±1,61%.

Таким образом, разработана методика количественного определения суммы аминокислот в листе каштана конского обыкновенного с использованием спектрофотометрии.

Выводы

1. Подобраны оптимальные условия методики для спектрофотометрического определения суммы аминокислот листа каштана конского обыкновенного по реакции с нингидрином.

2. Разработана методика количественного определения суммы аминокислот в пересчете на РСО глютаминовой кислоты.

3. Количественное содержание суммы аминокислот в пределах 0,77% (в пересчете на глютаминовую кислоту).

4. Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет ±1,61%.

Литература:

1. Гринштейн Дж., Виниц М. Химия аминокислот и пептидов, пер. с англ., [М.], 1965;

2. Гончарова Т.А., Гончарова Т. А. Энциклопедия лекарственных растений:— М.: Изд. дом "МСП", 1997.

3. Дзюба В.Ф., Николаевский В.А. Щербаков В.М. Коренская И.М. Лекарственные растения в фитотерапии Практическое пособие. - Воронеж: Изд-во ВГУ, 2004. - 83 с.

4. Р.М. Середин С.Д. Соколов Лекарственные растения и их применения Ставрополь, 1969.

5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. — М.: Медицина, 1983. — С. 426-579.