Филогенетические особенности развития половых клеток у хряков разных генотипов и процесс оплодотворения у свиней

Аннотация. Использование интерференционной микроскопии при оценке генетических и морфологических показателей спермы хряков позволяет устанавливать размеры, количество сухого вещества, белков и ДНК в головках спермиев, формы и частоту встречаемости патологичных спермиев в эякуляте хряка и даёт экспресс метод оценки хряков-производителей по их воспроизводительным качествам.

Ключевые слова: свинья, спермий, яйцеклетка, ядро, цитоплазма, ДНК, порода.

Вступление. Основным фактором повышения генетического потенциала свиней является точность оценки животных. На каждом этапе селекционного процесса, наряду с использованием общепринятых методов оценки экстерьера животных, оценки спермы по густоте, активности и концентрации, необходимо проводить более глубокие, современные исследования с оценкой морфологического и генетического потенциала половых клеток, как самца, так и самки, в зависимости от видовых, возрастных и породных особенностей.

По данным А.Банникова, В. Флинта дикий кабан появился в нижнем олигоцене в Европе и был самым первым диким животным из семейства Suidae, подвергнувшимися доместикации [1]. Свиньи – это наиболее распространенный вид одомашненных животных с широким ареалом. По данным ФАО, в настоящее время в мире насчитывается около 730 пород и породных типов свиней, большую часть из которых разводят в Европе и Китае, в частности, 270 из них считаются редкостными. Одновременно 58 пород (25 региональных и 33 международных), зарегистрированных как широкораспространенных, то есть они размножаются более чем в одной стране [6]. Достоверно, что в мире наиболее распространенными являются пять пород: крупная белая (117 стран), дюрок (93страны), ландрас (91 страна), гемпшир (54 страны) и пьетрен (35 стран) [2]. Возникает вопрос, каков же путь филогенеза этого вида, какие биологические и генетические различия между современными породами свиней и их исходными формами.

Материалы и методы. Для изучения биологических и генетических особенностей исследовали нативную сперму хряков современных мясных пород в сравнении с особенностями половых клеток спермы хряков дикого европейского кабана, который является генетическим корнем при создании отечественных и зарубежных пород свиней. Мазки спермы хряков для интерференционной микроскопии изучали при использовании микроскопа МР1-5, состоящего из поляризатора, анализатора и двоякоприломляющих призм Волластона, позволяющих получать раздвоенные изображения спермиев с противоположенными сдвигами фаз световых волн [7].

При этом изучали как морфологические, так и генетические показатели спермы. Частоту дефектов строения подсчитывали в процентах к общему числу спермиев в поле зрения в интерференционном контрасте, подсчитывалось не менее 1000 половых клеток на различных участках мазка. В интерферационном микроскопе различимы дефекты спермиев, классифицируемые по Э. Блому [8]: мажорные дефекты – дегенеративные, двойные формы, пуговичная акросома, подвижный отдельный хвост, диадема головки, грушеобразные головки, маленькие аномальные головки, отдельные патологические головки, штопорообразный митохондриальный чехлик, проксимальная капелька, псевдокапелька и др. До мажорных относят 15 дефектов спермы. До минорных относят узкие головки, маленькие нормальные головки, гигантские и широкие короткие головки, дистальная капелька, простой излом хвоста, кольцеобразный хвост и др., всего 9 дефектов. Появление минорных аномалий спермиев, в основном обусловлены действием внешних факторов (содержание, кормление животных и т.д.), а появление мажорных дефектов очень часто обусловлено как генотипом производителя, так и влиянием некоторых паратипических факторов. Наряду с этим, нами проведены биологические исследования по возрастным особенностям размеров яичников и яйцеклеток у свиней крупной белой породы.

Результаты и их обсуждение. При исследовании спермы хряков домашних и диких животных, наиболее информативными показателями ее качества являются не только подвижность спермиев, концентрация, но и целостность структуры клеток, количество ДНК и белков в головках спермиев. Исследовали нативную сперму хряков крупной белой породы, ландрас, дюрок и гибридных хряков ландрас × дюрок, а также сперму дикого европейского кабана. Морфофункциональные показатели спермиев дикого кабана и хряков современных пород представлены в таб. 1.

Таблица 1

Морфологические показатели спермы диких и домашних хряков

Анализ данных таблицы 1 показал, что у дикого европейского кабана длина головки спермия достоверно уступала по размерам половых клеток современным отечественным и зарубежным породам свиней. Однако по ширине головки спермия и длине средней части спермия наблюдается достоверное превосходство у Sus scrofa ferus. Средняя часть сперматозоида или тело спермия имеет мощный митохондриальный аппарат, который способствует как активности, так и адаптивности спермы у дикого европейского кабана. По общей площади головки спермия различия не достоверные.

Содержание сухого вещества в головке спермия и соотношение белка и ДНК представлено в табл. 2.

Таблица 2

Содержание сухого вещества в головках спермиев хряков

Исследования показали, что если по сухой массе головки спермиев у дикого кабана и одомашненных свиней различия незначительные, то в соотношении дезоксинуклеиновой кислоты и белка в головке спермия и частоте дефектов в строении половых клеток наблюдаются более существеннее различия. Так, крупная белая порода свиней, созданная в 1851 году в Великобритании, по происхождению от дикого европейского кабана имеет с ним общее филогенетические корни и одинаковое соотношение в головке спермия белка и ДНК (67,4 - 32,6). Датская порода ландрас филогенетически создана при широком участии крупной белой породы свиней. Исследования показали, что у хряков породы ландрас соотношение в головке спермия белка и ДНК (69,6 и 30,4%), а у гибридных хряков (67.47 и 32,53%).

Сперматогенез происходит у хряков во все сезоны года и в течении всего периода половой жизни. У дикого европейского кабана этот процесс изучен недостаточно. У вида Sus scrofa мужская половая клетка резко отличается от женской по величине, форме и подвижности. Длина спермиев колеблется от 35 до 78 мкм, а длина головки от 7 до 10 мкм. Основой головки сперматозоида является ядро, где от 30,4 до 36,5% сухого вещества содержится ДНК.

Яйцевые клетки самки – самые крупные в организме. Они богаты желтком – запасные питательные материалы. У свиноматок диаметр яйцеклетки и зародыша на первых стадиях дробления - 165±0,8 мкм, объем 3,6240млн. μ³, максимальный диаметр 188,8 мкм. При этом проявляются как возрастные, так и видовые особенности. Наши расчеты показали, что при средней площади головки спермия 32 мкм² и толщине – 1,2 мкм, объем головки спермия – 38,4 μ³ или в 110 тыс. раз меньше, чем объем яйцеклетки (табл. 3).

Таблица 3

Линейные размеры яйцеклеток у свиноматок разного возраста (мкм)

Процесс оплодотворения. Особенность оплодотворения у свиноматок заключается в том, что яйцеклетки благодаря биологической жидкости, выделяющейся из фолликулов, и засасывающим сокращением яйцевода быстро проходят верхнюю половину яйцевода. Располагаются яйцеклетки обычно группой. Процесс оплодотворения происходит в верхней трети яйцевода в результате чего образуется зигота. Зигота способна к дальнейшему росту и развитию. В самом процессе оплодотворения выделено четыре следующие одна за другой стадии[3-5].

В первой стадии в верхней трети яйцевода происходит встреча яйцеклеток со сперматозоидами. При этом сперматозоиды, выделяя фермент гиалуронидазу разрыхляют фолликулярные клетки яйца. В разрыхлении фолликулярных клеток яйца не существует строго видовой специфичности сперматозоидов по отношению к яйцеклетке. У свиней стадия разрыхления фолликулярных клеток почти отсутствует, так как яйцеклетки при прохождении яйцепровода освобождаются от фолликулярного слоя клеток.

Во второй стадии сперматозоиды проникают через прозрачную оболочку яйцеклетки. В этой стадии уже существует строгая видовая избирательность сперматозоидов. Исследования показали, что сперматозоид проникает в тело яйцеклетки наклонно, внедряясь в её плазму головкой вместе с протоплазматической частью хвоста. При этом акросома спермия является важнейшей органеллой половой клетки, состояние которой в значительной степени определяет оплодотворяющую способность яйцеклетки. Это связано с тем, что внутри акросомы содержится фактор первого этапа оплодотворения – фермент гиалуронидаза, необходимый для разрыхления клеток лучистого венца яйцеклетки, скрепленного гиалуроновой кислотой. Кроме того, в акросоме содержится ингибитор другого важного фактора оплодотворения – трипсиноподобный фермент акрозин, который локализован под акросомой в протоплазме спермия и во внутренней ядерной мембране. Акрозин необходим для осуществления важного этапа оплодотворения – проникновения спермия через прозрачную оболочку яйца. Акрозин разжижает небольшой участок в оболочке и открывает проход для проникновения спермия. Ингибиторы акрозина содержащиеся в акросоме, не позволяют ферменту проявить свою активность раньше времени и произвести разрушительное действие на другие структуры спермия. Кроме того, неповрежденная акросома не дает возможности вытечь акрозину во внешнюю среду. После контакта спермия с яйцеклеткой происходит так называемая акросомная реакция – отторжение акросомы, а с ней и ингибиторов акрозина, что обеспечивает возможность прохождения второго этапа оплодотворения. Морфологически акросома формирует передний край головки сперматозоидов и может быть выявлена микроскопически с использованием фазового контраста или флюоресценции.

В третей стадии происходит проникновение сперматозоида в тело яйцеклетки. В результате избирательности в тело яйцеклетки из прозрачной оболочки проникает только один сперматозоид, растворяющий ферментом гиалуронидазой протоплазму яйца, в результате чего выделяется второе полярное тельце яйцеклетки с половинным набором хромосом. В этот период происходит полное созревание яйца. Протоплазма сперматозоида растворяется в протоплазме яйца, и их пронуклеусы (ядра) сливаются.

В четвертой стадии происходит ассимиляция ядер сперматозоида и яйцеклетки с образованием зиготы. Следует различать многоплодие потенциальное, эмбриональное и фактическое. Под потенциальным многоплодием - подразумевают число образовавшихся яйцеклеток в яичниках маток за один половой цикл. У свиней созревает за один половой цикл, в среднем 15-25 яйцеклеток, однако около 30-50 % их погибает до и после оплодотворения на различных стадиях развития плода. По этому показателю оценивают эмбриональное многоплодие. Фактическое многоплодие – это количество родившихся живых поросят за один опорос. Потенциальное многоплодие у свиноматок базовых пород (крупная белая, ландрас) в норме 17-25 яйцеклеток, а фактическая -10-15 поросят в гнезде, хотя биологический потенциал свиноматки по многоплодию -30-40 яйцеклеток и 26-34 поросят за опорос от свиноматки. В наших исследованиях на крупной белой породе свиней самая крупная масса яичников наблюдается у полновозрастных свиноматок, у которых наибольшая живая масса, а наименьший – у молодых свинок. Более крупные яичники, как правило, содержат большее количество фолликулов, что положительно сказывается на потенциальном и фактическом многоплодии маток.

Выводы

1. Впервые удалось получить нативную сперму у дикого европейского кабана (Sus scrofa ferus) и провести сравнительный анализ морфофункциональных показателей спермы дикого кабана и хряков современных пород.

2. Вариабельность сухой массы головок нативных спермиев у всех исследуемых пород хряков была сравнительно не большой и находилась в пределах 5-7%, что указывает на высокое качество исследуемой спермы.

3. Оплодотворяющая способность спермы зависит от сухой массы головок спермиев, количества ДНК в них и целостности структур клеток.

4. Метод интерференционной микроскопии позволяет достоверно производить морфологическую оценку размеров половых клеток, определять количество сухого вещества, белков и ДНК в головках спермиев и дифференцировать различные дефекты в строений спермиев.

5. Размеры и масса яичников изменяются с возрастом и находятся в прямой зависимости от общего развития свиноматок. Полновозрастные свиноматки имеют наиболее крупные яичники и самое высокое потенциальное многоплодие.

6. Линейные и объемные размеры яйцеклеток у молодых свиноматок мельче, чем у взрослых, что свидетельствует об их биологической неравноценности по сравнению с яйцеклетками взрослых маток.

Литература:

1. Банников А.Г., Флинт В.Е. Жизнь животных.-Т.7.-М.: Просвещение, 1989.-с.426-434.
2. Гладырь Е.А., Эрнст Л.К. Изучение генома свиней (Sus scrofa) с использованием ДНК – маркеров // Сельскохозяйственная биология, 2009, -№2.- С. 16-27.
3. Жегунов Г.Ф., Цитоплазматические основы жизни. – Х.: Золотые страницы, 2004, -С.499-569.
4. Квасницкий А.В. О физиологических резервах в свиноводстве// Свиноводство, 1980. - №7. – С.8-9.
5. Походня Г.С. и др. Опыт интенсивного воспроизводства свиней.–М.: знания, 1989.–64 с.
6. Состояние мировых генетических ресурсов животных. Доклад по состоянию мировых генетических ресурсов животных. – Рим, Секретариат ФАО. – 2002. - 63 с.
7. Bath A.D., Oko R.J. Abnormal morphology of bovine spermatozoa // Iowa State University Press.-1989.-281 p.
8. Blom E. Sperm morphology with reference to bull infertility // First All – Indian Symp. Anim. Rehrod. Ludhiana. -1977 - P.61-81.