Актуальность определения серопейзажа пневмококка обусловлена ведущей ролью Streptococcus pneumoniae в структуре инфекций дыхательных путей. По мнению ВОЗ, эта одна из наиболее часто возникающих бактериальных инфекций у человека. К заболеваниям, вызываемым S.pneumoniae, относятся пневмонии, менингиты, средние отиты и синуситы.
В настоящее время единственным эффективным способом существенно повлиять на заболеваемость пневмококковой инфекцией является вакцинация. Однако успех вакцинопрофилактики пневмококковой инфекции зависит от степени соответствия серотипового состава вакцины спектру циркулирующих пневмококков данного региона. Данные настоящего исследования о циркулирующих серотипах S.pneumoniae позволят обосновать включение определенной наиболее эффективной пневмококковой вакцины в национальный календарь иммунизации Республики Беларусь (РБ).
Ключевые слова: пневмококк, серотип, серопейзаж, Мультиплекс ПЦР-серотипирование.
1 Обзор литературы
Распространенность пневмококковых инфекций во многих регионах мира неизвестна. Это обусловлено недостаточным проведением лабораторных тестов у госпитализированных больных (менее чем у 50 %).
В странах, где исследования проводились, показано, что заболеваемость зависит от возраста. Это продемонстрировано в США [4]: заболеваемость для детей 6–11 мес. — 235 на 100 000, от 0–12 мес. — 165 на 100 000, с 12–23 мес. — 203 на 100 000, старше 7 лет — 6,1 на 100 000. Заболеваемость пациентов 45–64 лет — 2,8–10,1 на 1000, старше 65 лет — 18 на 1000, причем в этой возрастной группе пневмония с бактериемией в 10–60 % приводит к летальному исходу. В Европе показатель заболеваний, обусловленных S.pneumoniae, варьирует от 10 до 100 на 100 000 населения, у людей 65 лет составляет 61 на 100 000.
Ежегодно от пневмококковой инфекции в мире умирает более 1,5 миллиона человек, в том числе 716 тыс. детей в возрасте до 5 лет и, в основном, младше 2 лет [4]. Таблица 1 демонстрирует количество смертей, которых можно было бы избежать вакцинацией.
Таблица 1
Количество смертей, которые можно предотвратить вакцинацией, данные за 2003 год (WHO Global Immunization Vision and Strategy, April 2005)
|
Инфекция |
Дети младше 5 лет |
Дети старше 5 лет |
Всего |
|
Полиомиелит |
<100 |
1,000 |
1,000 |
|
Гепатит В |
1,000 |
599,000 |
600,000 |
|
Дифтерия |
4,000 |
1,000 |
5,000 |
|
N. meningitidis |
10,000 |
16,000 |
26,000 |
|
Столбняк |
198,000 |
15,000 |
213,000 |
|
Коклюш |
293,000 |
1,000 |
294,000 |
|
H. influenzae В |
386,000 |
0 |
386,000 |
|
Ротавирусная инфекция |
402,000 |
47,000 |
449,000 |
|
Корь |
480,000 |
50,000 |
530,000 |
|
Streptococcus pneumoniae |
716,000 |
896,000 |
1,612 000 |
В странах СНГ частота инвазивных пневмококковых заболеваний точно не известна. Предполагают, что ее распространенность не отличается от США. По данным В. К. Таточенко, у 88 % из 281 ребенка, госпитализированного с пневмонией, выявлен пневмококк, что сравнимо с данными США.
Цель работы — отработка методики Мультиплекс ПЦР-серотипирования; определение серотипов S.pneumoniae, выделенных от больных с диагнозами пневмония, отит, находящихся на лечении в стационарах города Минска, Республика Беларусь.
2 Материалы и методы
Использованная методика — Мультиплекс ПЦР-серотипирование.
2.1 Забор биологического материала
Для выделения ДНК S.pneumoniae с последующим определением серотипа, серогруппы производился забор крови, мокроты, гнойного содержимого среднего уха. Биоматериал забирался у пациентов 9-ой и 2-ой взрослых и 3-ей детской городских клинических больниц г. Минска согласно строгим нормативам по забору и транспортировке. После доставки штаммов в лабораторию проводилось их субкультивирование, накопление культуры и проверка чистоты.
2.2 Мультиплекс ПЦР-серотипирование
Для постановки Мультиплекс ПЦР-серотипирования мы придерживались протокола, предложенного Centers for Disease Control and Prevention (CDC), с использованием латиноамериканской клинической панели (Таблица 2) [3].
Таблица 2
Латиноамериканская панель. Порядок сетов и определяемые в них серотипы
|
Номер сета п/п |
Определяемые серотипы |
|
1 |
6, 9V, 14, 19A, 23F |
|
2 |
6, 6C |
|
3 |
3, 15B, 17F,18, 19F |
|
4 |
1,5, 7F, 9N, 16F |
|
5 |
2, 4, 8, 20, 22F |
|
6 |
7C, 10A, 11A, 12F, 23A |
|
7 |
13, 15A, 21, 33F, 35F |
|
8 |
23B, 35A, 35B, 38, 39 |
|
9 |
10F, 24, 31, 34 |
2.3 Анализ продуктов амплификации при проведении электрофореза
Анализ результатов производили с помощью электрофореза на 2 % агарозном геле в TBE буфере при 100 V в течение 1,5 часов. Гель окрашивали бромидом этидия. Визуализацию результатов электрофореза проводили в УФ-свете на приборе гель-документации. Размеры продуктов ПЦР определялись путем сравнения с молекулярным стандартом (50 bp ladder; Fermentas).
3 Полученные научные результаты
При проведении данного исследования получены первые результаты о циркулирующих серотипах S.pneumoniae в г. Минске (таблица 3).
Таблица 3
Результаты Мультиплекс ПЦР-серотипирования
|
Страна |
Культура |
Результат ПЦР, включая серотип |
|
Республика Беларусь, г. Минск |
S.pneumoniae |
S.pneumoniae serotype 19 F |
|
Республика Беларусь, г. Минск |
S.pneumoniae |
S.pneumoniae serotype 19 F |
|
Республика Беларусь, г. Минск |
S.pneumoniae |
S.pneumoniae serotype 14 |
|
Республика Беларусь, г. Минск |
S.pneumoniae |
S.pneumoniae serotype 19 F |
|
Республика Беларусь, г. Минск |
S.pneumoniae |
S.pneumoniae serotype 19 F |
|
Республика Беларусь, г. Минск |
S.pneumoniae |
S.pneumoniae serotype 19 F |
|
Республика Беларусь, г. Минск |
S.pneumoniae |
S.pneumoniae serotype 19 F |
|
Республика Беларусь, г. Минск |
S.pneumoniae |
S.pneumoniae serotype 19 F |
4 Заключение
В ходе данного исследования отработана методика постановки Мультиплекс ПЦР-серотипирования. Полученные результаты доказали возможность успешного использования данной методики для серотипирования Streptococcus pneumoniae в Республике Беларусь.
Было доказано отношение 7 образцов пневмококка к серотипу 19F и одного к серотипу 14.
Определена дальнейшая необходимость проведения Мультиплекс ПЦР-серотипирования S.pneumoniae для установления серопейзажа в РБ, с целью дальнейшего выбора эффективной современной пневмококковой вакцины, которая будет включена в республиканский календарь иммунизации населения.
Литература:
1. World Health Organization. «Laboratory methods for the diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae» (2nd edition). // 2011. 104с.
2. Sylvia H. Yeh, Alejandra Gurtman, David C. Hurley, Stan. L. Block, Richard H. Schwartz, Scott Patterson, Jack Love, Emilio Emini «Immunogenicity and Safety of 13-Valent Pneumococcal Conjugate Vaccine in Infants and Toddlers». // 2011. 278с.
3. http://www.cdc.gov/streplab/pcr.html — официальный сайт CDC (Center for Disease Control and Prevention), дата последнего обращения — 28.09.2014 г.
4. Харит С. М. Пневмококковая инфекция и ее профилактика // Санкт-Петербург. 2009. 56с.
5. Gray B. M. Pneumococcal microbiology and immunity // 2002. — № 31. с 233–240.
