Надежность ПЦР-анализа при обнаружении m.tuberculosis и мутации гена rpoB при исследовании различного диагностического материала

Введение: Проблема лекарственной устойчивости (ЛУ) m.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам остается на сегодняшний день актуальной. Нужно отметить что, наряду с легочной формой ТБ наблюдается тенденция к нарастанию внелегочных форм ТБ. С 2002 по 2011 гг. не наблюдалось тенденций к снижению показателей регистрации внелегочного ТБ, тогда как распространенность ТБ сокращалась. В результате этого доля пациентов с внелегочным ТБ возросла с 16 % в 2002 г. до 22 % в 2011 г. Так как симптомы этой формы ТБ размыты или могут напоминать симптомы других заболеваний, врачи могут поздно диагностировать внелегочный ТБ или вообще не распознавать его [2]. Клиническое значение определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) возбудителя, выделанных от больных туберкулезом, в максимально короткие сроки постоянно возрастает, что связано, в первую очередь, с появлением штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ), устойчивых к нескольким противотуберкулезным препаратам (ПТП), в первую очередь с множественной (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) [1]. Генетическая устойчивость к тому или иному ПТП проявляется вследствие спонтанных хромосомных мутаций, происходящих при частоте от 10–⁶ до 10–¹⁰ репликацией микобактерий. Развитие лекарственной устойчивости МБТ к рифампицину связано с возникновением мутаций в гене rpoB. Мутации, приводящие к устойчивости, препятствуют связыванию препарата с ферментом и расположены, главным образом, в определенной области гена rpoB, получившей название «участок, определяющий устойчивость к рифампицину». У 86 % штаммов МБТ устойчивость к рифампицину связана с заменой одной их трех аминокислот: Ser531Leu (41 %), His526Leu (36 %) или Asp516Tyr (9 %) [1]. Необходимо отметить, что применяемые на сегодняшний день микробиологические методы выявления и характеристики микобактерий, являясь основными методами диагностики туберкулеза, весьма трудоемки, дороги, плохо стандартизуемы и длительны, что существенно снижает диагностическую ценность проводимых исследований, увеличивает сроки постановки и подтверждения диагноза, приводит к позднему выявлению больных — активных бактериовыделителей, вынуждает врачей эмпирически назначать противотуберкулезную терапию и не позволяет проводить своевременную коррекцию лечения в случае развития устойчивости [6]. Таким образом, актуальной темой в мировом масштабе для ранее диагностики внелегочных форм ТБ является разработка и применение ускоренных и эффективных методов исследований. С появлением ПЦР стало возможным в миллионы раз увеличить концентрацию определенных фрагментов ДНК в комбинированном генетическом материале за несколько часов [3]. Одним из важнейших функций ПЦР является идентификация патогенных микроорганизмов, возбудителей заболеваний человека, животных и растений [4].

Cистема GeneXpert была запущена в эксплуатацию в Узбекистане 2012 г. «Xpert MTB/RIF» — тест система в формате картриджа, где проходит выделение ДНК МБТ из диагностического материала пациента, мультиплексная ПЦР в режиме реального времени (REAL-TIME-PCR) для одновременного выявления МБТ и определения генетических детерминант лекарственной устойчивости (мутаций) к рифампицину в гене rpoB МБТ и автоматическая интерпретация результатов реакции в молекулярном анализаторе «GeneXpert» [1,5]. Тест Xpert MTB/RIF имеет аналитическую чувствительность пяти геномных копий очищенных ДНК и 131 КОЕ/мл M. tuberculosis, добавленных к мокроте [3]. Молекулярные маяки, которые нацелены на ген «rpoB», охватывают все мутации, обнаруженные в >99,5 % штаммов, устойчивых к рифампицину [3].

Цель исследования: изучить эффективность выявления m.tuberculosis при исследовании различного диагностического материала с применением ПЦР в режиме реального времени на платформе Xpert MTB/RIF.

Материалы и методы исследования: Исследования проводилась в Национальной Референс лаборатории Республиканского специализированного научно-практического медицинского центра Фтизиатрии и Пульмонологии в г. Ташкент. Для достижения поставленной цели было обследовано диагностические материалы, таких как: операционный материал, моча, спинномозговая жидкость и др. взятых у 354 больных. Из них мужчины составили 213 (60 %) и женщины 141 (40 %). Исследованнные образцы с целью диагностики составляло у 247 (70 %) и ранее леченнқх 108 (30 %). Некоторые из диагностических материалов до проведения теста были деконтаминированы с помощью NaOH (Гидроксид натрия) или NALC (N — ацетил — L — цистеин) методом посева на питательные среды.

Результаты и обсуждения: Из 354 больных было выявлено 113 (40 %) положительных МБТ результатов. Мутации в гене rpoB, которая спровоцировала резистентность к противотуберкулезному препарату рифампицин, составила у 38 (30 %), чувствительность у 75 (60 %), чувствительность не определено у 12 (10 %). Проведенный анализ позволил выявить из 113 пациентов с отрицательным результатом микроскопии 50 положительных результатов МБТ. Т. е. у 50 пациентов микроскопия с отрицательным результатом была подтверждена молекулярно генетическим методом положительно, из них 14 (28 %) МЛУ. Среднее время детектирования на аппарате GeneXpert составило для одного теста в среднем 2 часа, для микроскопии 1 день. Подробная информация о результатах исследования представлена в таблице 1.

Таблица 1

Результаты исследования на оборудования GeneXpert

Примечания:RIF — рифампицин,МБТ — микобактерии туберкулеза, RIF не оценен — чувствительность к рифампицину по техническим причинам не определено.

Выводы:

1.                  Тест Xpert MTB/RIF может использоваться в качестве начального диагностического теста у лиц с подозрением на ТБ легочных и внелегочных патологиях.

2.                  Внедрение в практику молекулярно генетического метода Xpert MTB/RIF основанная на ПЦР в режиме реального времени значительно сокращает сроки проведения исследования, что верифицирует диагноз ТБ за 2 часа.

3.                  Быстрое выявление МЛУ-ТБ больных позволяет изолирование и начало раннего лечения противотуберкулезными препаратами.

4.                  Проведения анализа на аппарате GeneXpert сокращает образования инфекционных аэрозолей по сравнению с културальными методами, что дает возможность снизить риск распространение инфекции внутри лаборатории.

Литература:

1.                  Литвинова В. И., Морозова А. М. Лабораторные исследования при туберкулезе. — М.: МНПЦБТ, 2013. — С. 121–151.

2.                  Доклад ВОЗ/ECDC от 19 марта 2013 г. Чтобы остановить туберкулез в Европе, необходимо обеспечить надлежащее лечение. [электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.euro.who.int/ru/media-centre/sections/press-releases/2013/03/adequate-treatment-essential-to-stop-tuberculosis-across-europe-whoecdc-new-report (дата обращения: 22.09.2014)

3.                  Sigma-Aldrich. Количество ПЦР — анализ — техническое руководство. — С. 3.[электронный ресурс]. Режим доступа: www.galatrade.ru/pages/files_download.php?id=38 (дата обращения: 22.09.2014)

4.                  Глик. Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с. Англ. — М.: Мир, 2002. — С. 96.

5.                  Быстрое внедрение диагностического теста Xpert MTB/RIF: технические и операционные рекомендации. — С. 5–6. ВОЗ 2011.

6.                  Афанасьева М. В. Молекулярное типирование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis: дисс. канд. мед. наук. — М., 2008. — C. 3.