Антагонистическое действие E. coli в отношении клостридий и стафилококков



Эшерихии проявляют антагонистическое действие против клостридий и стафилококков, причем колициногенность к клостридиям проявляется наиболее заметно — все штаммы анаэробов, на довольно ощутимом расстоянии находятся от роста эшерихий; что касается стафилококков, действие на них E. сoli выражена довольно хорошо, но уступает проявлению антагонизма против клостридий. В тоже время, клостридии выступают в качестве доноров и передают эшерихиям — гемолитические, токсигенные и антигенные свойства. То же самое можно сказать и в отношении стафилококков — они выступают в качестве доноров, а эшерихии — реципиентов. Стафилококки передают эшерихиям гемолитическую активность, некротоксигенные свойства и резистентность к стрептомицину.

Ключевые слова: гемолитическая активность, свойство, стафилококк, антагонистическое действие, штамм, качество доноров.

Из предыдущих опытов было замечено, что при ассоциированном культивировании штаммов токсигенных клостридий и E.coli происходила постепенная элиминпция клеток анаэробов с жидкой питательной среды, что можно было бы связать с антагонистическим действием эшерихии на клетки клостридий.

Антагонистическое действие микроорганизмов связано с выработкой ими антибиотикоподобных веществ — бактериоцинов. Известны бактериоцины, продуцируемые эшерихиями — колицины, Cl. perfringens — велхицины, возбудителем чумы — пестицины и др.

Для изучения этого вопроса были использованы культуры E.coli и анаэробов, выделенные из внешней среды.

Материал весом 100 мг суспензировали в 10 мл стерильного МПБ, тщательно эмульгировали в 0,1 мл, переносили в свежий МПБ. Суспензии готовили в парных пробирках. Одну часть пробирок с содержимым прогревали в водяной бане при 80 ⁰ С 20 мин, другую часть оставляли без термического воздействия. Затем пробы инкубировали при 37 ⁰ С в течение 24 ч. По истечении указанного времени производили высевы с гретых и негретых проб в чашки Петри с глюкозокровяным агаром по Цейсллеру. Посевы инкубировали в аэробных и анаэробных условиях в течение 48 час. Рост на пластинчатых средах был отмечен в обоих сериях проб. На чашках, где высевалась гретая суспензия, культивируемая в условиях анаэробиоза, выросли колонии неоднородной формы с зоной гемолиза. При изучении основных биологических свойств они были отнесены к Cl. рerfringens, Cl. Septicum, Cl. oedematiens. Выделенные штаммы клостридий были патогенны для белых мышей; при подкожном заражении в дозе 0,5 мл, 2.109 м.т./мл, они убивали подопытных животных в течение 16–36 час. Штаммы Cl.рerfringens относились к типу А по результатам реакции нейтрализации.

В чашках с посевами негретой суспензии выросли колонии однородной формы; некоторые из них имели зону гемолиза и были вирулентны для белых мышей. При микроскопии мазков из колоний с гемолизом и без гемолиза обнаруживали грамотрицательные, короткие, довольно толстые палочки, расположенные одиночно и попарно. На среде Эндо образовывали колонии красного цвета с металлическим блеском. Эти и другие свойства позволяли отнести их к виду эшерихии.

В гретой суспензии выжили спорогенные формы, а эшерихии и другая неспорообразующая микрофлора погибли. Поэтому на пластинчатой среде (глюкозокровяной агар) выросли колонии разных видов клостридий. Там, где суспензии не подвергались термическому воздействию, эшерихии подавили рост спорогенных клостридий.

Чтобы удостовериться в подавлении роста токсигенных анаэробов культурами эшерихи, выбрали следующие штаммы клостридий: Cl. perfringens типов A 28, B 26, D 213; Cl.septicum A2, A 103, A 59; Cl. сhavoei B 1 и B 16; в качестве антагонистов использовали штаммы E. сoli, выделенные из внешней среды.

В чашки Петри с глюкозокровяным агаром по диаметру газона узкой полосой (штрихом) сеяли по одному штамму E. сoli 18 ч роста на МПБ (всего 10 штаммов), инкубировали при 37 ⁰ С 24 ч в аэробных условиях. По истечении указанного времени по линии роста культуры, перпендикулярно к ней с обеих сторон, на расстоянии 2 мм, штрихом наносили культуры указанных анаэробов; чашки с посевами помещали в анаэростаты и инкубировали при 37 ⁰ С в течение 24–48 ч. По истечении указанного времени наблюдали следующее: около линии роста E. сoli отсутствовал рост штаммов анаэробных микроорганизмов; так, например: у Cl. perfringens типа А 28 зона задержки роста составила 15 мм, В 216–17 мм, D 213–13 мм; у Cl. сhavoei B 1 отсутствовал рост на расстоянии 24 мм, В 16–22 мм; у Cl.septicum А 103–16 мм, А 59 — на 18 мм, А 2 — на 21 мм (см. таблицу 1). Далее проверили наличие антагонизма при одновременном посеве анаэробов и эшерихии на глюкозокроваяной агар. Для этого по диаметру газона питательной среды полосой наносили смыв с МПА клеток E. сoli и перпендикулярно к нему, отходя на 2 мм, штаммы указанных анаэробов; делали параллельные посевы; одни чашки инкубировали в аэробных условиях, другие — в анаэробных на протяжении 24–48 ч. В аэробных условиях росли только эшерихии;

Таблица 1

Антагонистическое действие E . С oli в отношении анаэробных бактерий; передача гемолитической активности, токсигенности и антигенности от клостридий к эшерихиям

Культуры клостридиев	Антагонизм — расстояние от роста E. сoli (в мм)	Гемолитическая активность, переданная E. сoli	Токсигенные свойства переданные E. сoli	Антигенные свойства, переданные E. сoli
Cl. Perfringens	Изоляты E. сoli
А 28	№ 1–15	+	+	1: 350
В 216	№ 2–17	+	+	1: 400
D 213	№ 3–13	+	+	1: 300
Cl.septicum
А 2	№ 4–21	+	+	1: 250
А 103	№ 5–16	+	+	1: 250
А 59	№ 6–18	+	+	1: 300
Cl. сhavoei
В 1	№ 7–24	-	+	1: 250
В 16	№ 8–22	+	+	1: 250

Примечание: + свойство передается; — свойство не передается

Из таблицы 1 видно, что у E. сoli антагонизм против клостридий выражен довольно хорошо, вместе с тем, несмотря на антагонизм со стороны эшерихий к клостридиям, при совокуплении эшерихий (малое число) с анаэробами, имеет место перенос нескольких свойств, о которых мы писали в предыдущих опытах, что среди эшерихий (два, три десятка) найдутся такие особы, которые способны входить в связь с клостридиями, они и получают от них гемолитические, токсигенные, антигенные свойства, детерминированные в плазмидной ДНК.

Изучая антагонизм, мы смогли получить заодно и перенос нескольких свойств — гемолитические, токсигенные и антигенные. В анаэробных — наблюдали рост всех посеянных культур, причем зону задержки роста штаммов клостридий не наблюдали.

Таким образом, при одновременном высеве клостридий и эшерихий на пластинчатой среде подавление роста анаэробов со стороны E. сoli не отмечено.

Проверили также влияние анаэробов на рост эшерихий. Для этого в чашки Петри с глюкозокровяным агаром радиальными линиями посеяли штаммы вышеуказанных анаэробов; в середине, по диаметру, оставляли свободное место шириной 6 мм. Посевы помещали в анаэростат пр температуре 37 ⁰ С на 36 ч — (это время достаточно для роста анаэробов на пластинчатой среде. По истечении указанного времени штаммы анаэробов росли нормально по радиальным линиям посева; затем, в оставленное по диаметру пространство сеяли штрихом (перпендикулярно к радиальным линиям анаэробов) штаммы E. сoli. Инкубировали посевы в аэробных и анаэробных условиях. По истечении 24 ч, 48 и 72 ч подавление роста штаммов E. сoli со стороны клостридий не наблюдали.

Такаим образом, на пластинчатой среде E. сoli подавляет рост анаэробов в том случае, если они будут высеены на определенное время раньше, достаточное для роста эшерихий и введения им в среду антагонистического фактора — колицинов, который, диффундируя в питательный агар, подавляет рост анаэробов. Подобное наблюдается и в жидкой питательной среде. Если в свежий МППБ одновременно внести инокуляты суточных культур анаэробов и эшерихий в первые три часа, оба представителя размножаются (E. сoli интенсивнее) удовлетворительно, но по прошествии 6–18–36 ч рост анаэробов полностью подавляется и они постепенно элиминируются из смешанной культуральной среды.

Если к активно растущей на МППБ культуре E. сoli добавить инокулят анаэробов (также с МППБ) в логарифмической фазе роста, то размножение клостридий полностью подавляется, а затем и постепенно элиминируется.

Несмотря на то, что эшерихии являются антагонистами клостридий, в жидкой питательной среде (бульон Кит-Тароци) клостридии до того как элиминируются, успевают войти в связь с эшерихиями и осуществить перенос плазмидной ДНК, заодно и токсигенные, гемолитические, антигенные и другие свойства. Перенос токсигенности контролировали заражением белых мышей; гибель подопытных животных была подтверждением переноса плазмиды, несущей маркер токсинообразования; эти же культуры эшерихии, которые несли уже свойство токсинообразования, испытали на одновременном сообщением им антигенности путем получения гипериммунной сыворотки у подопытных кроликов; гипериммунную сыворотку испытали на морских свинках — превентивные свойства были довольно высокими — от 1: 250 до 1: 350, 1: 400 (разведения сыворотки), которых испытали со штаммами вышеуказанных клостридий.

Перенос гемолитической активности испытали на глюкозокровяном агаре по Ценслеру, — негемолитические эшерихии становилис гемолитическими, выращивая их в аэробных условиях.

Следовательно, эти три маркера, которые, в данном опыте мы контролировали, явно подтверждают перенос их от анаэробных микроорганизмов (клостридии).

В проведенных опытах доказан антагонизм со стороны эшерихий в направлении к анаэробным микроорганизмам. Полученные результаты дают возможность сделать практические выводы: при возникновении диареи у человека и животных, вызванные клостридиями — Cl. Perfringens типа А, В, Е можно применять препараты, изготовленные из эшерихий, наиболее сильных антагонистов к анаэробам.; и,что очень важно, при раневых инфекциях, вызванных Cl. Perfringens типа А (гангрена) с успехом можно применять эшерихии, производя орошение раны. Причиной могут быть и другие анаэробы, против которых можно применять эшерихии, синтезируемые антибиотикоподобное вещество — колицины.

Далее изучали антагонистическое действие эшерихии на культуры стафилококков, но перед этим исследовали действие стафилококков, как доноров, к эшерихиям.

Использовали в качестве доноров стафилококк штамм № 209, а реципиентами E. сoli М 1 и К 12. В жидкой среде при совместном выращивании эшерихии подавляли рост стафилококков, в твердой среде имело место подобное явление. На твердой среде от роста эшерихии, только на расстоянии 25–30 мм росли стафилококки. Несмотря на такой выраженный антагонизм, эшерихии к стафилококкам в мазках из жидкой культуральной реды находили клетки обоих представителей соединенных между собой конъюгационным мостиком или спаренные оболочками. Проводили высев их на селективную среду, где выявляли передачу резистентности к стрептомицину от стафилококков к эшерихиям. Селективная среда содержала 3 ед/мл пенициллина и 16 ед/мл стрептомицина; стафилококки были чувствительны к пенициллину и резистентны к стрептомицину, а эшерихии были резистентны к пенициллину и чувствительны к стрептомицину.

На селективной среде вырощенные рекомбинанты эшерихии переносили в бульн Кит-Тароци и после 24 часов культивирования заражали кроликов — вводили инокулят внутрикожно 0,2 мл. На месте введения на 3-ий день у животных развивался воспалительный процесс, который кончался некрозом тканей.

Таким образом, стафилококки передавали эшерихиям гемолитическую активность, некротические свойства и резистентность к стрептомицину.

Из 15 штаммов эшерихий к стрептомицину резистентность приняли 9 штаммов, одновременно резистентность к стрептомицину и гемолитическую активность 6 культурам, все три маркера передавались (гемолитическая активность, некротоксигенные свойства, резистентность к стрептомицину) 3 штаммам независимо друг от друга и не являются в состоянии находящейся на близком расстоянии на генетической карте. Что касается фактора токсигенности, то это свойство детерминировано в плазмидной ДНК, в клетку реципиента переносится вместе с плазмидой.

Подтвердилось, что гибридные штаммы получали путем спаривания клостридии с эшерихиям, стафилококков с эшерихиями при совместном культивировании.

При изучении антагонизма между эшерихиями и стафикококками было замечено, что между этими двумя видами, несмотря на то, что колицины выделяющие E. сoli угнетали рост и развитие стафилококков, между ними были особи, которые спаривались и имела место передача от стафилококков к эшерихиям плазмидной ДНК, передавались три свойства — гемолитическая активность, некротоксигенные свойства и резистентность к стрептомицину.

Антагонизм изучали между эшерихиями и стафилококками по методике, описанной выше.

Эшерихиии 24 ч роста из жидкой среды переносили в МПА на чашки Петри — диаметральной линии, инкубировали при 37 ⁰ С 24 часа, обильный рост отмечали по линии посева E. сoli; перпендикулярной этой линии, радиально на расстоянии 2 мм от линии роста эшерихий, с обеих сторон сеяли по 5 штаммов стафилококков. Посевы инкубировали при 37 ⁰ С 24 часа. С линии роста эшерихии на расстоянии 25–33 мм была стерильная зона, каждая культура имела различные стерильные зоны.

При одновременном высеве обоих видов — эшерихии и стафилококков, угнетение роста стафилококков не наблюдали. Это указывает на то, что колицины не успевали диффундировать в среду, а за это время стафилококки, не подвергаясь губительному действию колицинов, росли и развивались. В жидкой среде, если их вносили вместе, то рост стафилококков не угнетался, только тем условием, что оба вида были со скошенного агара смыты физиологическим раствором и следовательно не содержали колицинов,колицины содержались только в бульонной культуре и при высеве эшерихии за 24 часа, в твердой питательной среде колицины успевали диффундировать в агар.

В отличие от действия на клостридии, эшерихии в логарифмической фазе роста, если внести вместе 24 часовые культуры роста, то их рост угнетается, но полностью не элиминируется.

Все сказанное надо учесть при кишечных заболеваниях, вызванных энтеробактериями, но следует подобрать штаммы эшерихий, выделяющие активные колицины, которые подавляют рост и размножение клостридий, стафилококков, протей, стрептококков, сальмонелл, и, что очень важно, попавшей из внешней среды Bac. anthracis (сибирская язва); тем самым эшерихии выполняют несравнено более полезную работу, чем появление энтеропатогенные и энтеротоксигенные штаммы кишечной палочки, которые детерминанты патогенности получают плазмидной ДНК от клостридий, хотя вред наносимый подобными эшерихиями весьма ощутим.

Таблица 2

Антагонистическое действие E . с oli в отношении стафилококков; передача гемолитической активности, некротоксигенных свойств, резистентности к стрептомицину от стафилококков к эшерихиям

Культуры (изоляты) стафилококков, выделенные из внешней среды	Антагонизм, — расстояние от роста E. сoli (в мм)	Гемолитическая активность, переданная E. сoli	Некротоксигенные свойства, переданные E. сoli	Резистентность к стрептомицину, переданная E. сoli
Стафилококки (изоляты)
№ 1 — белый	12	-	-	-
№ 2 — белый	14	-	-	+
№ 3 — белый	12	-	-	+
№ 4 — золотистый	15	+	+	+
№ 5 — белый	11	-	-	-
№ 6 — белый	14	-	-	-
№ 7 — лимонный	15	-	-	-
№ 8 — белый	16	-	-	+
№ 9 — золотистый	15	+	+	+
№ 10 белый	15	-	-	-

Замечание: + свойство передается; — свойство не передается

Как и с клостридиями, антагонизм E. сoli в отношении стафилококков выражен удовлетворительно, незначительно уступает клостридиям, что касается гемолитической активности, некротоксигенных свойств и резистентности к стрептомицину, стафилококки только двум штаммам передают первые два свойства, а резистентность к стрептомицину — 5 штаммам.

Следовательно, стафилококки (St. Aureus) выступают в качестве доноров, хотя и низкой частотой, передают E. сoli двум штаммам гемолитическукю активность и некротоксигенные свойства, резистентность к стрептомицину — пяти штаммам.

Таким образом, E. сoli проявляет антагонистическое действие против клостридий и стафилококков, причем колициногенность к клостридиям проявляется наиболее заметно — все штаммы анаэробов на довольно ощутимом расстоянии находятся от роста эшерихий; что касается стафилококков, действие на них E. сoli выражено довольно хорошо, но уступает проявлению антагонизма против клостридий. В то же время клостридии выступают в качестве доноров, а эшерихии — реципиентов. Стафилококки передают эшерихиям гемолитическую активность, некротоксигенные свойства и резистентност к стрептомицину.

Литература:

1. Начкебия Д., Начкебия Е. Д., Начкебия К. Д. Токсигенные клостридии как причинный фактор патогенности эшерихий //Известия аграрной науки, т.4, № 2. Тбилиси, 2006, с. 122–126.
2. Начкебия Д., Начкебия К. Д., Начкебия Е. Д. Влияние токсигенных клостридий на биологические свойства эшерихий и стафилококков //Известия аграрной науки, т. 9. Тбилиси, 2011, с. 97–104.
3. Начкебия Д. В. Влияние антибиотиков на свойства возбудителей анаэробных инфекций. Ветеринария № 9, 1972. Москва, из-во «Колос»б с. 55–58.
4. Кудлай Д. Г. Резистентность к стрептомицину брюшно-тифозных бактерий //В сб. тр. Акад. Мед.наук СССР, 1980, с.63
5. Трошкина Е. Т. Методы оценки устойчивости микроорганизмов к антибиотикам //Бюлл. ВИЭВ, 1970, вып. 8, с.99.