Способность к рекомбинации культур клостридий, эшерихий и стафилококков, выделенных из органов животных



Выделяли указанные микроорганизмы из внутренних органов (печень, селезенка, почки, легкие, сердце) и лимфатических узлов брюшной полости клинически здоровых животных. Пробы из внутренних органов весом 30–50 г и мезентериальные лимфатические узлы (по 3–5) брали сразу же после убоя клинически здоровых животных на Тбилисском мясокомбинате. Пробы смачивали спиртом, обжигали, а затем из более глубоких слоев стерильными инструментами вырезали небольшие кусочки весом до 1 г и помещали их в бульон Китт-Тароцци (Я. Р. Коваленко, 1964). Из каждого органа высевы производили в четыре пробирки. Половину пробирок подвергали воздействию высокой температуры — 75–80^° С в течение 20 мин. Затем гретые и негретые посевы инкубировали в термостате при 37^° С в течение 10 суток. При наличии роста проводили микроскопию мазков, окрашенных по Граму. Для получения чистых культур применяли глюкозо-кровяной агар по Цейсллеру с антибиотиком и без него. Для выделения анаэробов пользовались стрептомицином, учитывая сравнительно высокую устойчивость их к данному препарату (Е. Т. Тришкина, 1968). Глюкозокровяной агар готовили с концентрацией стрептомицина от 20 до 50 Ед/мл. такая концентрация антибиотика была достаточна для подавления роста некоторой сопутствующей микрофлоры и, главным образом, E. Сoli, которая очень часто находится в ассоциации с анаэробами, что затрудняло выделение их в чистой культуре, т. к. в процессе роста эшерихий постепенно элиминировали анаэробов из культуральной среды. Чашки с посевами на глюкозокровяном агаре помещали в анаэростат и инкубировали в термостате при 37⁰ С в течение 4–6 суток. Форму роста колоний на пластинчатой среде определяли по Цейсслеру. Колонии с характерным ростом отвивали вместе с кусочками агара в печеночный бульон (Я. Р. Коваленко, 1964). У выделенных штаммов изучали морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические и вирулентные свойства. Вирулентность культур проверяли заражением белых мышей и морских свинок.

Степень обсеменности патогенными клостридиями внутренних органов у разных видов клинически здоровых убойных животных неодинакова. Так, от 72 гол. крупного рогатого скота, при бактериологическом исследовании было выделено 40 изолятов, из них 18 были отнесены к Cl. сhavoei, 11 — Cl.septicum, 6 — Cl. oedematiens и 5 — Cl. perfringens. Из этих бактерий вирулентными оказались 2 изолята Cl.septicum, слабовирулентными — 2 изолята Cl. perfringens. и 1 изолят — Cl. oedematiens. Из органов 48 свиней было выделено 16 анаэробов; Cl. perfringens — 11, Cl.septicum — 4, Cl. oedematiens — 1. патогенными оказались 2 изолята Cl. perfringens.

От 44 овец выделили 18 анаэробов, в том числе Cl. perfringens — 9, Cl.septicum — 5, Cl. oedematiens — 4. Из 18 культур вирулентными оказался 1 изолят — Cl.septicum, слабовирулентным — 2 изолята Cl. perfringens.

Таблица 1

Анаэробные микроорганизмы, выделенные из органов крупного рогатого скота, овец исвиней

	Вид животных		Количество животных		Выделено анаэробов		Выделено микробов из отдельных органов
							П е ч е н ь									С е л е з е н к а							П о ч к и
							Cl. сhavoei		Cl. perfringens	Cl.septicum		Cl. oedematiens		Всего		Cl. сhavoei		Cl. perfringens		Cl.septicum	Cl. oedematiens	Всего	Cl. сhavoei	Cl. perfringens	Cl.septicum	Cl. oedematiens	Всего
	1		2		3		4		5	6		7		8		9		10		11	12	13	14	15	16	17	18
	КРС		72		40		9		2	5		3		19		4		2		2	3	11	2	1	1	-	4
	овцы		44		18		-		4	1		2		7		-		2		1	1	4	-	1	2	1	4
	сви- ньи		48		16		-		5	2		1		8		-		2		-	-	3	-	3	-	-	2
Вид животных		Количество животных	Выделено анаэробов	Выделено микробов из отдельных органов
				Лимфоузлы											Сердце								Легкие
				Cl. сhavoei		Cl. perfringens		Cl.septicum			Cl. oedematiens		Всего		Cl. сhavoei		Cl. perfringens		Cl.septicum		Cl. oedematiens	Всего	Cl. сhavoei	Cl. perfringens	Cl.septicum	Cl. oedematiens	Всего
1		2	3	19		20		21			22		23		24		25		26		27	28	29	30	31	32	33
КРС		72	40	2		-		2			-		4		1		-		1		-	2	-	-	-	-	-
овцы		44	18	-		1		1			2		4		-		-		-		-	-	-	1	-	-	1
сви ньи		48	16	-		1		1			-		2		-		-		-		-	-	-	-	-	-	-

Частота выделения анаэробов из конкретных приведена в таблице 1. Клостридии выделялись почти из всех органов, но чаще из печени, селезенки и почек.

Таким образом, из 104 исследованных животных выделены 74 изолята анаэробных микроорганизмов, 10 из них оказались вирулентными и слабовирулентныжм, в том числе Cl. perfringens — 6 изолятов, Cl. oedematiens — 1, Cl.septicum — 3. Инфицированность внутренних органов клинически здоровых животных достигает значительных размеров.

Те же органы убойных животных исследовали на присутствие эшерихий. Для подавления роста сопутствующей микрофлоры и особенно анаэробов в питательные среды (МПБ, МПА, агар Эндо) добавляли пенициллин в концентрации 5 Ед/мл. Посевы производили общепринятым способом, но среды инкубировали в аэробных условиях. Всего выделено 94 культуры E. сoli, в том числе от крупного рогатого скота — 48 изолятов, от свиней — 34, от овец — 12; 6 из них были слабовирулентными. По серологической типизации (по 0 — коли сывороткам (выделенные изоляты отнесены к следующим серогруппам: 0103, 078, 086.

Было выделено всего 14 изолятов стафилококков, относящихся к St. albus. В качестве питательных сред использовали МП с 10 % NaCl и МПА с 5 % кровью для определения гемолитической активности. Два изолята стафилококков содержали гемолитический фактор. Авирулентные штаммы клостридий, эшерихий и стафилококков, выделенные из внутренних органов клинически здоровых убойных животных, использовали в качестве реципиентов в опытах по конъюгации. Донорами служили эталонные токсигенные штамы анаэробов: Cl. perfringens A 28, B 216, D 211, C 219; Cl.septicum A 59; Cl. oedematiens A 79; Cl. сhavoei B 1.

Испытали 64 свежевыделенных штама анаэробных микроорганизмов. Все они были проверены на чувствительность к антибиотикам и отобрали резистентные к эритромицину и хлорамфениколу (доноры к этим антибиотикам были чувствительны). Из 64 изолятов устойчивых к антибиотикам оказались: к эритромицину — 19, тетрациклину — 14, хлорамфениколу — 23. Скрещивание проводили по описанной выше методике. Отбор трансконъюгантов вели с глюкозокровяного агара, содержащего тот или иной антиботик. Концентрация антибиотика в селективной среде была для штаммов резистентных к эриромицину — 16 Ед/мл, к тетрациклину — 18 Ед/мл и к хлорамфениколу — 22 Ед/мл. Штаммы доноров и реципиентов отбирали с глюкозокровяного агара (без антибиотика), переносили раздельно в бульон Китт-Тароцци, инкубировали 4 ч; при достижении концентрации 2–3.10⁸ м.т./мл брали по 1 мл и вносили в свежий регенированный бульон Китт-Тароцци, выдерживали в термостате 6 ч, затем разбавляли смешанно растущую культуру и растущие раздельно культуры доноров и реципиентов 1:1000 и 1:10000 соответственно. Высевали опытные пробы на селективную среду — глюкозокровяной агар, содержащий 50 Ед/мл стрептомицина и один из названных антибиотиков в указанной концентрации; доноры высевали на среду, содержащую только стрептомицин, реципиенты — только с одним из трех антибиотиков (эритромицин, тетрациклин, хлорамфеникол). Инокулят в объеме 0,1 мл наносили на пластинчатую среду. Из каждой пробы высевы делали на 10 чашках с селективной средой. Посевы инкубировали в анаэробных условиях в течение 36–48 ч. Затем из каждой опытной чашки отвивали по 10 колоний в бульон Китт-Тароцци, культивировали 18–24 ч и заражали белых мышей в дозе 0,5 мл подкожно. Предполагали, что в числе отсеянных колоний будут обнаружены рекомбинанты с сообщенной вирулентностью. Срезы выросших колоний 1–2 оказались токсигенными. Из 19 штаммов Cl. perfringens, взятых в качестве реципиентов, восприняли Ent-фактор от Cl. perfringens А 28–8, от В 216–4, от С 219–2, от D 211–3; из 17 штаммов Cl.septicum при скрещивании Cl.septicum А 59, способных к рекомбинации оказалось 7; из 10 штаммов Cl. oedematiens A 79–5; из 18 штаммов Cl. сhavoei скрещивались с Cl. сhavoei В 1–9. Результаты опыта приведены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты скрещивания авирулентных клостридий стоксигенными штаммами

Реципиенты и количество штаммов	Доноры	Количество штаммов реципиентов, способных к рекомбинации	% штаммов, резистентов, способных к рекомбинанции
Cl. perfringens — 19	Cl. perfringens А28 В 216 С 219 D 211	8 4 2 3	42,1 21,0 10,5 15,7
Cl.septicum-17	Cl.septicum А 59	7	41,17
Cl. oedematiens-10	Cl. oedematiens A 79	5	50
Cl. сhavoei — 18	Cl. сhavoei В1	9	50

Павших мышей вскрывали и делали высевы из крови сердца в бульон Китт-Тароции и на глюкозокровяной агар. Посевы инкубировали в условиях анаэробиоза при 37^° С. Через 24–36 ч культивирования отвивали выросшие колонии в бульон Китт-Тароции, инкубировали 18 ч, затем центрифугировали и надосадочную жидкость изучали в реакции нейтрализации (рН) для чего ее смешивали в объеме 0,5 мл с 0,5 мл антитоксической сывороткой соответствующего донора (сыворотку получали гипериммунизацией кроликов). Пробы выдерживали 45 мин при 37⁰ С, затем вводили по двум белым мышам внутрибрюшинно — 0,5 мл. В опытной пробе токсин инактивировался гомологичной донору антитоксической сывороткой и белые мыши оставались живы. Контрольные животные, которым вводили смесь токсина эталонных клостридий с физ. раствором погибали в течение 18–36 ч. Следовательно, имело место сообщение токсигенных свойств от эталонных штаммов клостридий к авирулентным штаммам анаэробов, выделенных из органов клинически здоровых убойных животных. Тем же путем передается резистентность к антибиотикам, в том числе и множественная устойчивость. При исследовании колоний рекомбинантов, которые получили свойство синтеза энтеротоксина, одновременно были устойчивы к тем антибиотикам, к которым были устойчивы доноры (эталонные штаммы). Очень важный факт, поскольку убойные животные –сырье для питания людей.

Как было указано выше, одновременно с анаэробами из тех же органов выделили 94 изолята E.coli, 6 из них были слабовирулентными. Авируентные штаммы кишечной палочки (88) использовали в качестве реципиентов для скрещивания с токсигенными донорами: Cl. perfringens А 28, В 216, С219, D 211; Cl.septicum А 59; Cl. oedematiens А 79; Cl. chauvoei D 1.

Все 88 штамма E.coli испытали с каждым из перечисленных культур донора.

Штаммы E.coli были резистентны к пенициллину и чувствительны к стрептомицину. Доноры, токсигенные анаэробы, были чувствительны к пенициллину и устойчивы к стрептомицину. Отбор рекомбинантов вели по передаче резистентности к стрептомицину. Селективные среды — глюкозокровяной агар и среда Эндо содержали 5 Уд/мл пенициллина и 40 Уд/мл стрептомицина. Скрещивание проводили по описанной методике. результаты опыта приведены в таблице 3. Из 88 изолятов E.coli, взятых в опыт, восприняли устойчивость к стрептомицину при скрещивании со штаммами Cl. perfringens типов А 28–31 изолят (35,2 %), с типом В 216–35 (39,8 %), с типом С 219–27 (30,7 %), с типом D211–24 (27,3 %); с Cl.septicum — А 59–21 изолят (23,9 %); с; Cl. chauvoei — 14 (15,9 %); с Cl. oedematiens — 14 (15,9 %).

Таблица 3

Скрещивание изолятов E.coli, выделенных из органов клинически здоровых убойных животных, со щтаммами токсигенных анаэробов

Реципиенты E.coli кол-во изолятов	Доноры –токсигенные клостридии	Кол-во штаммов реципиентов, способных к рекомбинанции	% штаммов реципиентов, способных к рекомбинанции
88	Cl. Perfringens А 28	31	35,2
88	Cl. Perfringens В 216	35	39,8
88	Cl. Perfringens С 219	27	30,7
88	Cl. Perfringens D211	24	27,3
88	Cl.septicum А 59	21	23,9
88	Cl. Oedematiens А 79	14	15,9
88	Cl. Chauvoei В 1	14	15,9

Перечисленные культуры рекомбинантов проверяли в реакции нейтрализации с антитоксическими сыворотками доноров. Мыши, зараженные смесью культуры рекомбинанта с гомологичной донору антитоксической сывороткой, оставались живы при гибели контрольных, зараженных, одновременно с устойчивостью к стрептомицину, сообщались и токсигенные свойства.

Ставили опыты также со стафилококками, выделенными из органов здоровых убойных животных. Из 14 изолятов 2 вызывали гемолиз эритроцитов на глюкозокровяном агаре. В качестве реципиентов испльзовали оставшиеся 12 изолятов Staphilococcus albus. Изучили их культуральные, биохимические, вирулентные свойства. Все изоляты ферментировали глюкозу, сахарозу, мальтозу, ксилозу, глицерин; разлагали в условиях анаэробиоза маннит; были чувствительны к стрептомицину в концентрации свыше 5 Ед/мл и проявляли резистентность к пенициллину в концентрации до 40 Ед/мл.

Донорами служили токсигенные штаммы анаэробов Cl. perfringens типов: А 28, В 216, D211, С 219; Cl.septicum типа А 59; Cl. oedematiens типа А 79; Cl. chauvoei В 1. Скрещивание проводили по методике, описанной выше. Рекомбинантов отбирали с глюкозокровяного агара, содержащего 5 Ед/мл пенициллина и 40 Ед/мл. стрептомицина; для реципиентов среда содержала 5 Ед/мл пенициллина, для доноров — 40 Ед/мл. стрептомицина. Посевы на селективные среды культивировали в аэробных условиях. Посевы доноров инкубировали в условиях анаэробиоза. Через 24–48 ч в опытных чашках обнаруживали колонии с зоной гемолиза (предлагаемые рекомбинанты), были и без гемолиза (в большем количестве). Колонии рекомбинантов, имеющие зону гемолиза, одновременно были резистентны и к стрептомицину. Отаивали их в МПБ и после 18 ч инкубирования заражали белых мышей дозой 0,5 и 1 мл, внутрибрюшинно. Зараженные мыши оставались живы, однако те, которым вводили 1 мл, переболевали тяжело. Белые мыши, зараженные культурами доноров, погибали в течение 10–14–18 ч от дозы 0,5 мл. а животные, зараженные культурами реципиентов, оставались живы. Рекомбинанты стафилококков приобретали устойчивость к стрептомицину и гемолитическую активность. Что касается передачи вирулентности, то она была выражена слабее и белые мыши, зараженные дозой в 1 мл, хотя и заболевали. но оставались живы. Для выяснения этого вопроса культуры рекомбинантов исследовали на способность ферментации маннита и плазмокоагуляции. Три из 7 изолятов рекомбинантов, полученных от скрещивания с Cl. perfringens, вызывали коагуляцию плазмы крови кролика. Реакцию плазмокоагуляции проводили при 38⁰ С. Неразведенная плазма свертывалась в течении 5–8 ч, а разведенная 1:2 свертывалась в течение 12 ч, 1:4 — в течение 18 ч. Из 12 штаммов реципиентов с Cl. perfringens скрещивались 7, с Cl.septicum А 59–3, с Cl. oedematiens А 79–2 и с Cl. chauvoei В1–2. Из числа рекомбинантов, полученных со скрещивания с Cl.septicum у одного изолята обнаружили гемолитическую активность вместе с положительной пробой на маннит и коагуляцией плазмы кролика. Рекомбинантам, полученным от скрещивания Cl. oedematiens и Cl. chauvoei была сообщена только резистентность к стрептомицину. Все культуры рекомбинантов, гемолизирующие эритроциты барана, ферментирующие и коагулирующие плазму крови кролика испытали на некротические свойства путем заражения кроликов внутрикожно 2-х млрд взвесью стафилококка на физрастворе NaCl в дозе 0,2 мл. Испытанные штаммы рекомбинантов стафилококков (albus) вызывали на 5–6 сутки некроз кожи. передача свойства некротоксинообразования осуществлялась как и переносы энтеротоксина. хотя выявлялась и слабее, чем у доноров. Совершенно отчетливо прослеживается передача гемолитической активности. Результаты опыта приведены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты скрещивания токсигенных анаэробов со стафилококками, выделенных из органов убойных животных

Кол-во штаммов реципиентов стафило-кокков (albus)	Штаммы доноров	Передаваемые признаки от клостридий к стафилококкам
		Гемолитическая активность	Летальные свойства	Дермонекротические свойства	Способность к плазмо коагуляции	Расщепление маннита в анаэробных условиях	Резистентность к стрептомицину
12 штаммов	Cl. perfringens
	A 28	5/12	3/12	3/12	2/12	-	7/12
	B216	5/12	4/12	4/12	3/12	-	6/12
	C 219	3/12	1/12	2/12	2/12	-	5/12
	D 211	4/12	2/12	2/12	3/12	-	5/12
	Cl. septicum
	A 59	2/12	1/12	1/12	1/12	1/12	3/12
	Cl.oedematiens
	A 79	1/12	0/12	1/12	1/12	0/12	3/12
	Cl. chauvoei
	B1	2/12	0/12	0/12	0/12	0/12	4/12

Примечание: В числителе количество способных к рекомбинации; в знаменателе — количество реципиентов

Второй вариант опыта проводили следующим образом. После того как смесь культур реципиентов и доноров инкубировалась в течение 6 ч, ими непосредственно (без отбора рекомбинантов с пластинчатой среды) заражали белых мышей. Материал вводили внутрибрюшинно в дозе 0,5 и 1 мл. От дозы 0,5 мл зараженные мыши оставались живы; от дозы 1 мл с опытных проб погибали 2–3 из 5 животных. Контрольные животные, зараженные культурами доноров с МПБ — погибали (доноры на МПБ низким столбиком не размножались и не накапливали токсин, в результате и не вызывали гибель мышей). Белых мышей, павших от опытных проб материала, вскрывали и произволили высевы из крови сердца на МПБ и глюкозокровяной агар с содержанием 5 Ед/мл пенициллина и 40 Ед,\мл стрептомицина. Посевы инкубировали в аэробных условиях в течение 24–36 ч. Рост отмечали как в жидкой, так и на пластинчатой среде. При микроскопировании мазков, окрашенных по Граму, обнаруживали только стафилококки. На пластинчатой среде были колонии как с гемолизом, так и без него. В среднем на глюкозокровяном агаре вырастали 5–6 колоний, 1–2 из них с гемолизом. Выросшие на пластинчатой среде рекомбинанты были отвиты в МПБ и исследованы на летальные, некротические, плазмокоагулирующие, сахаролитические свойства. Культуры рекомбинантов в более 5 пересевах на МПБ с интервалами в один месяц сохраняли гемолитическую активность, резистентность к стрептомицину, вирулентность и другие свойства.

Таким образом, как и в первом варианте опыта, реципиентым штаммам стафилококков сообщались гемолитические, дермонекротические, летальные свойства и устойчивость к стрептомицину.

Резюме

Клостридии, эшерихии и стафилококки, выделенные из внутренних органов животных, были распределены следующим образом: клостридии — 74 изолята, 10 из них оказались вирулентными и слабовирулентными, в том числе Cl. perfringens — 6, Cl. Oedematiens — 1, Cl.septicum — 3, эшерихии — 94 изолята, 6 из них были слабовирулентными; стафилококков — 14 изолятов, относящиеся к белым стафилококкам, два стафилококка содержали гемолитический фактор. Авирулентные культуры клостридий, эшерихий и стафилококков использовали в качестве реципиентов в опытах по скрещиванию с эталонными (вирулентными) штаммами клостридий; эталонные штаммы клостридий скрещивались с изолятами (авирулентными) в среднем 50 %, с эшерихиями — 35 %, стафилококками — 20 %. Передавались токсигенность, гемолитические свойства, антигенность, резистентность к антибиотикам. Для получения чистой культуры наиболее пригодна кровь из сердца.

Литература:

1. Начкебия Д., Парцвания Б. Клостридии во внутренних органах животных //Сакартвелос соплис меурнеоба, № 3, 1978. Тбилиси.
2. Начкебия Д., Парцвания Б. патогенные клостридии в паренхиматозных органах клинически здоровых убойных животных //Труды Груз.СХИ, т. 103, Тбилиси, 1978.
3. Начкебия Д. Обсемененность внутренних органов с.-х. животных штаммами E. coli и Cl. perfringens // Материалы I респ. конф. молодых ученых и специалистов // Тбилиси, ГЗВУИИ, 1979.
4. Начкебия Д. Передача патогенных свойств от Cl. perfringens к E. coli // Конф. микробиол. Закавк. республик. Тбилиси. 1989.
5. Начкебия Д. передача патогенных свойств от Cl.septicum к E. coli // Конф. микробиол. Закавк. республик. Тбилиси, 1989.