Ключевые слова: L-треонин, Escherihia Coli, биотехнологическое производство, аминный азот, пути биосинтеза.
В последнее десятилетие главным путем научно-технического прогресса стал уход от химических технологий к биотехнологиям, которые позволяют синтезировать необходимые вещества и соединения с более высоким качеством и низкой стоимостью сырья.
Среди соединений, полученных биотехнологическим методом, аминокислоты занимают первое место по объему производства и второе место по стоимости, уступая лишь антибиотикам [5, c.121].
На сегодняшний день в качестве монопродуктов в России можно приобрести лизин, метионин, треонин, триптофан, аргинин, валин и другие аминокислоты. Третей по потребляемости аминокислотой на российском рынке является треонин. Однако основной проблемой является то, что в нашей стране нет предприятий по его производству. Потребность в треонине покрывается за счет импорта из зарубежных стран.
Из всех возможных способов производства аминокислот предпочтение отдается микробиологическому синтезу. Его очевидным преимуществом является то, что микроорганизмы продуценты образуют только активные L-формы аминокислот [2, c. 203].
Для микробиологического синтеза аминокислот применяются разнообразные штаммы микроорганизмов. Большинство диких штаммов способны продуцировать аминокислоты во внешнюю среду только в микроколичествах. Поэтому генетиками разрабатываются и создаются штаммы-мутанты, способные синтезировать аминокислоты в больших количествах [3, c. 448]. Так в последние годы для получения более эффективных штаммов-продуцентов начали применять методы генной инженерии, которые позволяют увеличить количество генов биосинтеза путем их клонирования на плазмидах, что в свою очередь приводит к увеличению количества ферментов ответственных за синтез аминокислот и, следовательно, повышается выход продуцента [4, c. 184].
Повысить продуктивность штаммов, можно за счет условий ферментации и подобрав наиболее подходящий состава питательных сред, которые будут использоваться для культивирования микроорганизмов.
Все физико-химические процессы, протекающие в клетках микроорганизмов, в большей или меньшей степени связаны с составом сред, в которых происходит культивирование. Любой сдвиг в их составе непременно изменяет темп метаболизма и нарушает конечный выход культивируемого вещества. Для промышленного культивирования микроорганизмов и получения необходимых веществ, важно знать оптимальный баланс веществ в питательных средах и необходимо подобрать наиболее сбалансированный их состав [1, c. 83].
Для производства L-треонина наиболее часто применяют штаммы бактерии Escherichia coli. В результате подбора наиболее подходящих компонентов можно добиться максимально высокого уровня продуктивности исследуемого штамма.
Нами были исследованы морфологическая характеристика и функциональная активность штамма Escherichia coli ВКПМ В-12204 при содержании в ферментационной среде различных источников аминного азота (дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, дрожжевой экстракт ультрафильтрованный, пептон дрожжевой, пептон мясной, триптон казеиновый, кукурузный экстракт) [6, c.544].
Цель нашей работы заключается в выявлении морфологической характеристики и функциональной активности штамма Escherihia Coli ВКПМ В-12204.
Условия ферментации
Исследуемый штамм Escherihii Coli имеет регистрационный номер ВКПМ В-12204 и был привезен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и получен в ФГУП ГосНИИгенетика (г. Москва). Согласно паспорту штамма является хорошим продуцентом L-треонина (до 100 г/л) при соблюдении условий ферментации. Для наращивания биомассы инокулянта готовили питательную среду (Среда А) следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт — 35 г, калий фосфорнокислый однозамещенный — 2,52 г, натрия хлорид — 2,50 г, глюкоза — 3,0 г, вода до 1000 мл.
Для проверки продуктивности клона и посевного материала готовили ферментационные среды с различными источниками аминного азота (г/л): дрожжевой автолизат (сух.) — 2,0 г, сульфат аммония — 10,0 г, калий фосфорнокислый однозамещенный — 2,0 г, сульфат железа семиводный — 0,02 г, сульфат марганца пятиводный — 0,02 г, натрия хлорид — 0,6 г, глюкоза — 40,0 г, сульфат магния семиводный — 0,4 г, кальций углекислый — 20,0 г, вода до 1000 мл.
Ферментационные среды с дрожжевым экстрактом, дрожжевым экстрактом ультрафильтрованным, пептоном дрожжевым, пептоном мясным и триптоном казеиновым готовили по той же методике, что и ферментационную среду с дрожжевым автолизатом.
Ферментационная среда для проверки продуктивности клона и посевного материала с кукурузным экстрактом имеет следующий состав (г/л): кукурузный экстракт (сух.) — 10,0 г или кукурузный экстракт (сжижен) — 20,0 г, сульфат аммония — 10,0 г, калий фосфорнокислый однозамещенный — 2,0 г, сульфат железа семиводный — 0,02 г, сульфат марганца пятиводный — 0,02 г, натрия хлорид — 0,6 г, Bis-TRIS буфер — 50,0 г, глюкоза — 40,0 г, сульфат магния семиводный — 0,4 г, вода до 1000 мл.
Во всех ферментационных средах отдельно стерилизовали: 0,5 % раствор магния сернокислого семиводного — в течение (20±1) мин при температуре (121±2) ◦С, давлении 0,08 Мпа, 50 % раствор глюкозы — в течение (20±1) мин при температуре (121±2) ◦С, давлении 0,08 Мпа, 20 г кальция углекислого — в течение (20±1) мин при температуре (121±2) ◦С, давлении 0,08 Мпа.
Далее производили контроль стерильности питательных сред посредством высева на чашку Петри с агаризованной средой LB с биотином и глюкозой. Так же производили контроль питательных сред по следующим показателям: оптическая плотность, pH, количество глюкозы, азота и сухих веществ.
Состав и приготовление агаризованной среды LB с биотином и глюкозой (г/л): пептон — 10 г, дрожжевой экстракт — 5 г, хлористый натрий — 10 г, глюкоза — 5 г, агар — 15 г, вода до 1,0 л, pH 7,0–7,1. Все компоненты среды, за исключением глюкозы, стерилизовали вместе.
Для проверки стерильности посевного материала использовали агаризованную среду LA (Среда Лурия) следующего состава (г/л): пептон — 15 г, дрожжевой экстракт — 5 г, хлористый натрий — 5 г, агар — 15–20 г, вода до 1,0 л, pH 7,0–7,1.
Для проведения исследования вначале проводили оживление криокультуры штамма Escherihia coli ВКПМ В-12204. Далее засевали культуру на жидкую питательную среду (Среду А) из расчета 1 криопробирка на две колбы Эрленмейера по 1,0 л содержищие по 75 мл питательной среды. Затем колбы помещали на шейкер и выращивали посевной материал при температуре 37˚С, 320 об/мин в течении 6 часов. По прошествии 6 часов колбы снимали с шейкера и производил высев на чашки Петри с агаризованной средой LA (среда Лурия) для проверки на стерильность, затем производили отбор 3 мл инокулянта для измерения оптической плотности и pH.
Завершающим этапом была постановка эксперимента, который проводили на 7 ферментационных средах с различными источниками аминного азота в 3-х кратной повторности (всего 21 колба). Для этого стерильной стеклянной пипеткой отбирали 21 мл инокулянта из колбы Эрленмейера на 1,0 л с заранее подготовленным посевным материалом и переносили его в колбу Эрленмейера на 0,10 л.
Далее в 21 колбу Эрленмейера вместимостью 0,250 л вносили по 15,0 мл разных ферментационных сред (таблица 1) и добавляли по 1,0 мл инокулянта (посевного материала). Колбы помещали на шейкер на 37°С, 320 об/мин. Ферментацию проводили в течении 24 часов.
Таблица 1
Ферментационные среды иисточники аминного азота
|
Название ферментационной среды (ФС) |
Содержание аминного азота (%) |
|
ФС с дрожжевым автолизатом |
≥3,0 % |
|
ФС с дрожжевым экстрактом |
>4,0 % |
|
ФС с дрожжевым экстрактом ультрафильтрованным |
>5,0 % |
|
ФС с пептоном дрожжевым |
>4,0 % |
|
ФС с пептоном мясным |
≥3,0 % |
|
ФС с триптоном казеиновым |
≥2,5 % |
|
ФС с кукурузным экстрактом и буфером Bis-TRIS |
≥2,0 % |
Через 24 часа колбы снимали с шейкера, производили высев на стерильность на агаризованную среду LA для визуального контроля стерильности и соответствия морфологических характеристик. Так же проводили микрокопирование, методом «живой капли», для визуального контроля размеров клеток продуцента. В каждой пробе проводили определение оптической плотности, pH, содержания сухих веществ, глюкозы и треонина.
Результаты и их обсуждение
В результате эксперимента были полученны следующие данные, представленные в таблице 2.
Таблица 2
Показатели продуктивности Escherihia coliВКПМ В-12204 при культивировании штамма всредах сразличными источниками аминного азота
|
№п.п. |
Источник аминного азота |
Часы роста |
Значение глюкозы (остат.) |
Значение ОП |
Значение pH |
Значение треонина (мг) |
|
1 |
Дрож. автолизат |
24 |
16,67±0,75 |
10,01±0,68 |
5,25±0,03 |
5,43±0,15 |
|
2 |
Дрож. экстракт |
24 |
18,01±0,58 |
8,64±0,73 |
5,29±0,04 |
4,12±0,14 |
|
3 |
Дрож. экстракт ультраф. |
24 |
0,33±0,30 |
17,56±1,33 |
7,23±0,13 |
8,35±0,20 |
|
4 |
Пептон дрож. |
24 |
18,20±0,49 |
10,05±0,12 |
5,32±0,02 |
3,26±0,07 |
|
5 |
Пептон мясной |
24 |
15,15±0,16 |
8,81±0,05 |
5,32±0,02 |
1,69±0,03 |
|
6 |
Триптон казеиновый |
24 |
14,73±0,22 |
9,90±0,22 |
5,33±0,02 |
1,86±0,05 |
|
7 |
КЭ + буфер Bis-TRIS |
24 |
0 |
22,39±1,44 |
6,33±0,04 |
11,44±0,17 |
Анализируя данные таблицы 2, можно пронаблюдать зависимость продуктивности штамма от оптической плотности, остаточной глюкозы и pH среды. Высокая оптическая плотность свидетельствует о более активном размножении клеток и соответственно увеличении количества продуцируемого треонина. Кроме того, продуктивность штамма Escherihia coli ВКПМ В-12204 зависит от значения pH среды. Чем ближе оно к нейтральному (pH = 7,0) значению, тем активнее происходит усвоение глюкозы микроорганизмами и соответственно выше показания биосинтеза треонина. Так же о продуктивности штамма можно судить по значению остаточной глюкозы, чем ближе данный показатель к нулю, в конце культивирования, тем выше продуктивность микроорганизма.
Самый наибольший выход количества треонина наблюдается при культивировании штамма в ферментационной среде с кукурузным экстрактом с добавлением буфера Bis-TRIS и составляет 11,44 мг, что на порядок выше показаний в других ферментационных средах.
Аналогом среды с кукурузным экстрактом может служить среда с дрожжевым экстрактом ультрафильтрованным, продуктивность в ней составила 8,35 мг.
Самая низкая продуктивность штамма Escherihia coli ВКПМ В-12204 наблюдалась на ферментационных средах с пептоном мясным (1,69 мг) и триптоном казеиновым (1,86 мг).
Морфология клеток штамма Escherihiа coli ВКПМ В-12204 в различных ферментационных средах не изменена. Для бактериальных клеток характерен полиморфизм.
Литература:
- Безбородов А. М.. Биохимические основы микробиологического синтеза. — М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. — 83 c.
- Грачева И. М., Кривова А. Ю.. Технология ферментных препаратов. — 3. — М.: Элевар, 2000. — 203 c.
- Грачева И. М., Гаврилова Н. М., Иванова Л. А. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. — М.: Пищевая промышленность, 1980. — 448 с.
- Евстигнеева Р. П.. Тонкий органический синтез.– М.: Химия, 1991. — 184 с.
- Квеситадзе Г. И., Безбородов А. М.. Введение в биотехнологию. — М.: Наука, 2002. — 121 с.
- Тюкавкина, Н.А., БауковЮ.И.. Биоорганическая химия. — М.: Дрофа, 2005. — 544 с.
