Итоги маркер-ассоциированного отбора и картирование QTL, определяющих проявление агрономически и хозяйственно ценных признаков у яровой мягкой пшеницы в Самарском НИИСХ



Введение. Одной из самых сложных проблем в прикладной генетике и селекции является проблема наследственности и изменчивости по количественным признакам. Спектр генов, детерминирующих среднюю величину и генетическую дисперсию количественного признака, как правило, определяется лимитирующим фактором внешней среды [2]. Смена лимитирующего фактора влечет за собой также смену спектра генетических локусов, определяющих изменчивость признака [1, 8].

Тем не менее, в настоящий момент установлено существование отдельных ключевых локусов хромосом, которые при любых условиях вносят свой вклад в формирование данного количественного признака, хотя мера этого вклада регламентируется внешней средой [3, 6, 8, 9, 13].

Локусы количественных признаков (quantitativetraitloci, QTL), составляют главный интерес современного молекулярного подхода к селекции полигенных признаков, в том числе маркер-опосредованной селекции-МАS (англ. markerassistedselection) [13]. Одна из задач этого направления состоит в идентификации, изучении, картировании и клонировании QTL, влияющих на варьирование фенотипических признаков [8].

В начале 1990-х начал действовать Международный проект по молекулярно-генетическому изучению гексаплоидной пшеницы, получивший название «InternationalTriticeaeMappingInitiative» (ITMI). Созданная в рамках этого проекта картирующая популяция рекомбинантных инбредных линий (РИЛ) была насыщена молекулярными RFLP [12] и SSR [14] маркерами. Всего картировано около 800 RFLP и более 2 тыс. микросателлитных маркеров [14].

Посредством этой популяции для некоторых генов, контролирующих, например твердость зерна (Ha), реакцию на яровизацию (Vrn1 и Vrn3), устойчивость к листовой ржавчине (Lr34) с уже известной хромосомной локализацией, совершенно независимо было подтверждено их месторасположение в геноме [11]. В России исследования с использованием данной картирующей популяции связаны с лабораторным изучением и локализацией QTL, определяющих показатели качества зерна [5, 8].

В предыдущие годы нами было проведено изучение картирующей популяции ITMI и выявлены селекционно-значимые гены и кандидаты в гены (QTL).

Цель работы заключается в получении экспериментальных данных для выявления молекулярных маркёров, сцепленных с хозяйственно-важными признаками и создании на этой основе новых генотипов с комплексом ценных коадоптированных блоков генов.

Новизна состоит в отсутствии целостной методики маркёр-ассоциированного отбора.

Материал и методика исследований. Научные исследования в 2016 году выполнялись на базе лаборатории генетики и селекции яровой мягкой пшеницы Самарского НИИСХ в сотрудничестве с ВНИИ растениеводства им. Н.И.Вавилова и Лейбниц-Институт генетики растений и исследования возделываемых культур, г. Гатерслебен, Германия. В работе использовали картирующую популяцию ITMI (InternationalTriticeaeMappingInititative), которая была получена скрещиванием яровой пшеницы сорта Opata 85 c синтетическим гексаплоидом W7984 (Aegilopstauschii / Altar 84) [12, 14]. Анализ признаков проводили по принятым ВИР методикам [7]. QTL анализ был выполнен с помощью компьютерных программ: MAPMAKER/EXP 3.0 [10], QGENE и STATISTICA 6.0 [12].

Достоверность взаимосвязи между выявленными локусами полиморфизмом по тому или иному признаку оценивали на основе порогового значения логарифма шансов LOD-score (logarithmofodds) [4].

Результаты исследований

В 2014 г. по результатам изучения картирующей популяции ITMI в гибридизацию с местным селекционным материалом (Альбидум 653) включены линии 31, 42, 58, 59, 60, 80, 94. Эти линии прогенотипированы по интересующим нас маркёрам (табл. 1), и к этим маркёрам подобраны праймеры:

Таблица 1

Наличие у линий ITMI генов/локусов, маркированных SSR-маркёрами

Маркёр	Xgwm341	Xgwm614	Xgwm71.1	Xgwm295-1	Xgwm 261	Xrz 395	Xgwm 121
Хром.	3D	2A	2A	7D	2D	5AL	5DL
Ген	QTL	QTL	QTL	Lr34/Pm38	Rht8a	Vrn1	Vrn3
Признак	Масса 1000 зёрен	Число зёрен в колосе	Число зёрен в колосе	Уст-ть к бур. рж. и мучн. росе	Редукция высоты	Отз-ть на яро-виза-цию	Отз-ть на яровиза-цию
ITMI 31				+
ITMI 42					(+)
ITMI 58	+			+	+		+
ITMI 59	+	+	+		+		+
ITMI 60		+	+	+	+
ITMI 80		+	+
ITMI 94				+
Альб653						+

В 2015-2016 гг. эти линии высевались в ручном посеве. Благодаря сотрудничеству с институтом им. Н. И. Вавилова мы получили фотографии электрофореза пцр-скрининга этих семи линий и родительской формы Альбидум 653 (рис. 1, 2, 3).

Рис. 1. Слева праймер Xgwm 533 (Opata -120 bp, Synth – 316 bp); справа праймер Xgwm 261 (Opata -164 bp, Synth – 194 bp)

Рис. 2. Слева праймер Xgwm 341 (Opata -166 bp, Synth – 157 bp); справа праймер Xgwm 71.1 (Opata -126 bp, Synth – 124 bp)

Рис. 3. Праймер Xgwm 295 (Opata -254 bp, Synth – 258 bp)

В результате изучения популяции ITMI в 2014 г. и анализа данных математической и статистических обработок выявлены QTL по двум репродукциям линий ITMI (семена из Безенчука и Оригинальные семена, Gatersleben), детерминирующие ряд количественных признаков у яровой мягкой пшеницы. Также показано переопределение генетических формул по семи количественным признакам и установлены молекулярные маркеры генетически сцепленные с идентифицированными QTL (таблица 2).

Таблица 2

Локализация кандидатов в гены и QTL, определяющие количественные признаки у яровой мягкой пшеницы по двум репродукциям (Безенчук, 2014 г.)

Среднее значение признака По всем линиям ITMI
РС-2013 г			ОС-2014г
Признак	Хромо сома	Маркер	Хромо сома	Маркер
Продолжительность периода всходы - колошение, дн (VSH).	5A	Xrz395b	5A	Xgwm1057, Xgwm129a, Xrz395b
Высота растений (PH)	5A	Xgwm415*, Xgwm129a	5A	Xgwm129a, Xgwm415, Xbcd1871b
Устойчивость к P.recondita (LRRb)	4B	Xgwm149, Xgwm935b	3B	Xksug53a, Xgwm779b, Xgwm533a
Устойчивость к P.recondita (LRRn)	4B	Xgwm149, Xgwm368	3B	Xksug53a, Xgwm779b, Xgwm533a
Длина верхнего междоузлия (StLuI)	5A	Xgwm415	5A	Xgwm129a, Xgwm415, Xgwm1057
	5D	Xgwm639a	7D	Xgwm780, Xgdm84, Xgwm1154
Число зерен в колосе (NSeSp)	6B	Xgwm219 Xgwm1076	7A	Xfba097
			5A	Xgwm1171a
Масса 1000 зерен (1000GM)	3A	Xpsr903b	1A	Xmwg55, Xgwm778
			5A	Xabg391, Xgwm415

*- жирным шрифтом выделены маркеры со значениями LOD >3; обычный шрифт – маркеры с LOD ≥ 2,5 <3.

По итогам 2014 г. можно сделать вывод, что помимо условий внешней среды репродукция также оказывает существенное влияние на экспрессию генов, детерминирующих количественные признаки у яровой мягкой пшеницы.

В период с 2015-2016 гг. также проводились исследования на тему влияния репродукций семян линий ITMI на проявление количественных признаков (таблица 3) и продолжился поиск маркеров, сцепленных с данными признаками на яровой мягкой пшенице (таблица 4). В стрессовых условиях двух последних лет из-за продолжительного воздействия высоких температур в критические фазы развития растений между репродукциями наблюдались менее выраженные отличия по всем признакам (таблица 3).

Таблица 3

Влияние репродукций семян линий ITMI на проявление количественных признаков яровой мягкой пшеницы (Безенчук, 2014-2016 гг.)

N п/п	Признак	Среднее значение признака По всем линиям ITMI
		2014 г		2015 г			2016 г
		РС-2013 г	ОС- 2014г	РС-2013г	ОС- 2014	РС-2011г	РС-2013г	ОС- 2014г
1	Продолжительность всходы - колошение, дн.	56,29	51,18	43,38	44,03	43,93	31,1	30,77
	Довер.интерв.	2,02	2,19	0,84	0,65	0,92	1,2	1,17
2	Высота растения, см	50,46	54,96	35,97	35,32	34,66	49,88	49,8
	Довер.интерв.	2,31	2,28	1,31	1,15	1,28	1,79	1,50
3	Длина верхнего (колосоносного) междоузлия,см	20,87	22,63	10,14	10,13	10,09	20,1	20,11
	Довер.интерв.	1,45	1,15	0,56	0,54	0,56	0,85	0,75
4	Длина колоса, см	9,85	9,88	8,24	8,30	8,46	8,74	8,69
	Довер.интерв.	0,29	0,33	0,04	0,05	0,04	0,26	0,19
5	Число зерен в колосе	26,43	30,13	11,31	11,50	12,28	18,5	17,26
	Довер.интерв.	2,65	2,82	0,29	0,37	0,31	1,65	1,41
6	Масса 1000 зерен, гр	34,64	37,69	29,76	29,70	30,47	31,68	30,33
	Довер.интерв.	1,85	1,54	1,30	1,27	1,19	1,57	1,75

Таблица 4

QTL, выявленные у картирующей популяции ITMI в условиях Безенчука (2013-2015 гг.)

Признак	Символ	Эксперименты
		2013		2014		2015
		Хромосома	Маркер	Хромосома	Маркер	Хромосома	Маркер
Высота растений	PH	5D (141.5) 5D (129.5)	Xgwm121b Xgwm1253	5A (191.8) 5A (192.6)	Xgwm129a Xgwm415	5A (192.6) 5A (191.8)	Xgwm415 Xgwm129a
Период всходы-колошение	VSH			5A (213.3) 5A (191.8)	Xgwm1057 Xgwm129a	5A (190.8) 5A (191.8)	Xgwm293a Xgwm129a
Длина верхнего междоузлия	StLuI	2B (239.7)	Xmwg950	5A (191.8) 7D (135.6)	Xgwm129a Xgwm780	5A (192.6)	Xgwm415
Положение флагового листа	LFP	7B (29.0)	Xgwm344	2A (0.0)	Xksuf11b	5B (113.3)	Xgwm777
Длина флагового листа	LFL	5D (168.6)	Xgwm174	3B (76.2)	Xgwm108	2D (255.1)	Xgwm296a
Ширина флагового листа	LFW			6A (101.9)	Xcdo1428	2D (319.2)	Xmwg682b
Восковой налет на колосе	SpWB			2D (295.8) 2D (287.8)	Xbcd18a Xgwm886	2D (284.4) 2D (295.8)	Xgwm702 Xbcd18a
Размер стеблевого узла	StNS			1B (78.2)	Xgdm126b	1B (179.6)	Xgwm1050
Длина колоса	SpL	4A (120.7)	Xbcd1670a	6A (101.9) 2B (223.7)	Xcdo1428 Xbcd152a	6A (101.9)	Xcdo1428
Длина ости	LSp			7A (294.6) 5A (74.4)	Xgwm1187a Xcdo1326a	5A (221.5)	Xbcd1871b
Устойчивость к листовой ржавчине, проценты	LRRn			3B (269.1) 3B (264.8)	Xksug53a Xgwm779b	4B (58.0)	Xgwm149
Число колосков в колосе	NSpt	2A (144.0)	Xgwm1115	5A (47.3)	Xabg391	5A (213.3)	Xgwm1057
Число зерен в колосе	NSeSp			7A (84.7)	Xfba097	7A (69.8)	Xgwm746a
Масса 1000 зерен	1000GM			1A (110.8) 5A (47.3)	Xmwg55 Xabg391	3A (66.5)	Xpsr903b
Масса зерна с колоса	WGrS			7A (84.7)	Xfba097	7B (257.3)	Xgwm46

*- жирным шрифтом выделены маркеры со значениями LOD >3; обычный шрифт – маркеры с LOD ≥ 2,5 <3.

Выводы. Таким образом, на фоне относительно благоприятных метеоусловий 2014 г. и засушливых 2015-2016 гг. был проведен фенотипический анализ количественных и качественных признаков картирующей популяции ITMI. На основе изучения популяции, выявлены и генотипированы семь наиболее ценных по комплексу признаков рекомбинантных линий ITMI, а также созданы гибриды этих линий с местным адаптированным селекционным материалом для дальнейшего изучения эффективности маркёр-ассоциированного отбора. Было показано переопределение генетических формул по 15 количественным признакам и установлены молекулярные маркеры генетически сцепленные с идентифицированными QTL.

По результатам исследований 2014-2016 гг. двух и трех вариантов репродукций, можно сделать вывод, что помимо условий внешней среды репродукция также оказывает влияние на проявление количественных признаков яровой мягкой пшеницы.

Литература:

1. Драгавцев, В. А. К проблеме генетического анализа полигенных количественных признаков растений. СПб: ВИР, 2003. 35 с.
2. Жученко, А. А. Рекомбинация в эволюции и селекции / А. А. Жученко, А. Б. Король. М.: Наука, 1985. 400 с.
3. Конарев, В. Г. Молекулярная биология в познании генетических и морфогенетических процессов у растений / В. Г. Конарев. СПб: ВИР, 2002. 51 с.
4. Кочерина, Н. В. Использование лод-оценки в картировании локусов количественных признаков у растений / Н. В. Кочерина, А. М. Артемьева, Ю. В. Чесноков // Доклады Россельхозакадемии. 2011. №3. С.14-17.
5. Пшеничникова Т. А. Картирование локусов количественных признаков, ассоциированных с показателями качества зерна мягкой пшеницы, выращенных в различных условиях среды / Т. А. Пшеничникова, М. Ф. Ермакова, А. К. Чистякова и др. // Генетика. 2008. Т.44. С. 90-101.
6. Сюков, В. В. Выявление QTL, определяющих количественные признаки у яровой пшеницы в условиях Среднего Поволжья / В. В. Сюков, Д. В. Кочетков, Н. В. Кочерина и др. // Вестник Саратовского ГАУ, 2012. №12. С. 91-94.
7. Филатенко, А. А. Широкий унифицированный классификатор СЭВ рода TriticumL. / А. А. Филатенко, И. П. Шитова. Л.: ВИР. 1989. 44 с.
8. Чесноков Ю. В. Картирование QTL, определяющих проявление агрономически и хозяйственно ценных признаков у яровой мягкой пшеницы в различных экологических регионах России / Ю. В. Чесноков, Н. В. Почепня, Л. В. Козленко и др. // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2012.Т. 16. С. 970-985.
9. Чесноков, Ю. В. Молекулярно-генетические маркеры и их использование в предселекционных исследованиях / Ю. В. Чесноков. СПб: АФИ, 2013. 116 с.
10. Lander, E. S. MAPMARKER: an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of exsperimental and natural populations / E. S. Lander, P. Green, J. Abrahamson // Genomics. 1987. V.1.P. 174-181.
11. Nelson J. C., Van Deynze A. E., Autrique E., Sorrels M. E., Lu Y. H., Negre S., Merlino M., Atkinson M., Leroy P. Molecular mapping of wheat. Homoeologous group 2 // Genome. 1995a. V.38. P. 516-524.
12. Nelson, J. C. QGENE: software for mapping – based genomic analysis and breeding // Mol. Bred. 1997. V.3.P. 239-245.
13. Tanksley, S. D. Mapping polygenes // Annu. Rev. Genet. 1993. V.27.P. 205-233.
14. Röder M. S., Korzun V., Wendehake K., Plaschke J., Tixier M. H., Leroy P., Ganal M. W. A microsatellite map of wheat // Genetics. 1998. V.149. N.4. P. 2007-2023.