Актуальность : Экологические, филогенетические, таксономические, палеоклиматические исследования молекулярно-генетическими методами анализа требуют сохранения биологического материала в ходе полевых сборов и до начала экстрагирования генетического материала в лаборатории. Сохранение целостности образцов дает возможность для дальнейшего проведения геномного секвенирования, ПЦР-анализа, а также для морфологического анализа и описания. Так как в школе недавно была открыта генетическая лаборатория, то нам стало важно подобрать наиболее практичный, экономически выгодный и эффективный метод экстрагирования ДНК.
Целью настоящей работы стало исследование эффективности разных методов экстрагирования ДНК
В связи с вышеобозначенной целью были поставлены следующие задачи:
- Провести экстрагирование промышленным набором.
- Провести экстрагирование рутинным методом.
- Сравнить разные методы экстрагирования, их эффективность и доступность.
Термины и определения
Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК ) — макромолекула (одна из трёх основных, две другие — РНК и белки), обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Молекула ДНК хранит биологическую информацию в виде генетического кода, состоящего из последовательности нуклеотидов.
Экстракция ДНК — совокупность методов извлечения высококонцентрированного экстракта ДНК, содержащегося в биологическом материале, в сравнительно очищенном и сепарированном виде для проведения дальнейших реакций и манипуляций (исследований, транскрибирования, репликации, редактирования, маркирования и проч.) с молекулой ДНК
Транскрипция ДНК — метод чтения последовательности нуклеотидов, составляющих цепочку ДНК. Разделяют биологическую (или естественную) транскрипцию, проходящую внутри клетки в процессе естественного жизненного цикла, и искусственную, осуществляемую в лабораторных условиях с целью определения и редактирования последовательности цепочки ДНК.
Полимеразы — группа ферментов, главной биологической функцией которых является синтез полимеров нуклеиновых кислот. ДНК-полимераза и РНК-полимераза синтезируют молекулы ДНК и РНК соответственно, путём комплементарного копирования родительских цепей ДНК или РНК.
ПЦР-метод — Полимеразная цепная реакция (ПЦР) —метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в биологическом материале (пробе).
Ингибиторы — группа веществ, подавляющих или задерживающих течение физиологических и физико-химических (главным образом ферментативных) процессов.
Центрифугирование — (в данном случае) метод гравитационного разделения взвешенного раствора (эмульсии) на фракции, совершаемый с помощью центрифуги.
Термостатированние/Инкубация — метод термической обработки материала (в том числе биологического), заключающийся в доведении (охлаждении или нагреве) материала до какого-то определенного значения и сохранение его в таком термически стабильном состоянии в течение определенного времени и при определенных физических условиях (давление, освещенность, влажность и т. д.). Для Т. применяются термостатические установки — автоклавы.
- Теоретическая часть
1.1 История открытия метода и его развития
Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — это «молекула жизни», вещество, с помощью которого кодируется основная наследственная информация в живых организмах на планете Земля. Всем нам хорошо знакома визуальная структура двойной спирали ДНК по многочисленным иллюстрациям в Интернете, картинкам в журналах и учебниках, в научно-популярных фильмах, на футболках, чашках и прочем инвентаре. Большинство из нас также знает о роли ДНК как универсального хранилища информации для живой материи. Однако эта роль была совсем не очевидна еще в недалеком прошлом. Группа Дж. Уотсона предложила свою модель строения ДНК и способ сохранения и передачи наследственной информации в ней только в 1953 году (за что ее члены получили Нобелевскую премию по химии в 1962 году), а точный структурный состав ДНК был определен группой Чарграффа в период 1949–1951 года (соотношение и взаимосвязь аденина — А, тимина — Т, гуанина -Г и цитозина — Ц). Экспериментальное же доказательство роли ДНК в передаче наследственной информации было получено только на рубеже 1940-х — 1950-х годов (группа Маклауда, О.Эвери, работы А.Херши и М.Чейз) [1].
До 1930-х годов считалось, что ДНК присутствует в клетках только животных. Однако исследования группы Белозерцева в СССР в 1930-х — 1940-х годах показали присутствие этого вещества в растительных клетках, а также в бактериях.
Однако всех этих замечательных открытий, перевернувших мировую науку, не произошло бы без открытия самого вещества ДНК и способов его извлечения.
ДНК была впервые выделена как химическое вещество И. Ф. Мишером в 1869 году из материала, полученного из гноя. Он-же определил базовый химический состав вещества (в который входил азот и фосфор) и установил его кислотные свойства. Долгое время, вплоть до открытия группы Уотсона, ученые не придавали ДНК большого значения, считая его элементом, с помощью которого клетка запасает фосфор. Все изменилось с открытием роли ДНК как основной молекулы, сохраняющей и передающей генетическую информацию.
1.2. Направления использования экстракции ДНК в науке и промышленности
Для проведения опытов с молекулой ДНК, определения и исследования ее последовательности необходимо получить химически чистые и стабильные образцы ДНК. Для этого были разработаны и применяются различные методы извлечения (экстракции) субстрата ДНК, содержащегося в биологическом материале. Эти методы различаются как по физическим и химическим принципам функционирования, так и по назначению.
Одни методы используются для быстрого экспресс-анализа биологического материала и не требуют высокой точности, другие, напротив, требуют высочайшей точности исследования и высочайшей степени очистки.
Где-же, кроме прикладных исследований свойств молекулы ДНК, используются еще методы экстрагирования ДНК?
Прежде всего, наибольшее распространение получили методы экспресс-экстракции ДНК при проведении структурных маркерных методов определения содержания конкретного биологического материала в образцах (прежде всего — подмножество ПЦР-методов исследования). ПЦР-тестирование применяется в широком спектре прикладных исследований от определения содержания ГМО (генно-модифицированных организмов) в образцах пищевой продукции (при импорте продуктов питания, сельхозпродукции и сырья в ходе ветеринарного контроля) до выявления болезнетворных инфекций (например — пресловутый ПЦР-тест на коронавирус).
Кроме того, экстрагирование ДНК широко применяется в различных методах транскрибирования (определение последовательности ДНК человека, животных и других биологических организмов), в криминалистике (при исследовании биологических проб), в определении родства, определении маркеров наследственных генетических заболеваний, при масштабных исследованиях популяций (например, при исследовании ареала распространения и смешивания разных гапло-групп), а также в процессе клонирования животных (в том числе давно вымерших), а также палео-археологии и палео-биологии (зоологии, ботанике).
Везде при этом крайне важно получить чистые и химически стабильные образцы и препараты, содержащие ДНК образца и не содержащие химических и биологических примесей.
1.3. Современные методы экстракции ДНК — перечень, описание и характеристика
В настоящее время наиболее распространены методы выделения (экстракции) ДНК при помощи диоксида кремния (силики), целлюлозных фильтров, ионообменной смолы, гель-фильтрации, магнитных частиц, метод выделения с применением бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ) и различные его модификации. Процесс включает в себя стадии лизиса, связывания, промывки и элюирования. Метод выбирается исходя из следующих факторов:
– какой биологический материал используется (животный или растительный, сухой или свежий, мертвый или живой, прочее);
– необходимая степень очистки;
– как быстро нужен результат;
– требуемое количество и назначение выделяемого материала (генетическое исследование, клонирование, синтез).
Экстракция при помощи диоксида кремния
К исследуемому образцу добавляют гуанидинтиоцианат, в результате чего все соединения, кроме нуклеиновой кислоты, денатурируют (связываются между собой). Далее осуществляется отмывка от других клеточных компонентов, а полученная молекула помещается в специальный раствор. Эта методика подходит для применения при наличии достаточного количества биологического материала. Она экономичная, быстрая, автоматизированная.
Выделение через целлюлозный фильтр
Используется специальный целлюлозный фильтр, пропитанный связывающими нуклеиновые кислоты буферами. Белки при этом денатурируются, а выделенная ДНК защищена от воздействия ультрафиолета и нуклеаз. Она имеет высокое качество и может храниться при комнатной температуре длительное время. Процедура происходит оперативно, возможна автоматизация процесса. Но такой способ достаточно дорогой и может применяться только для жидких образцов.
Экстракция магнитными частицами
В исследуемый образец добавляются магнитные шарики, которые связывают ДНК, и лизирующее средство. В процессе очищения оставшиеся клеточные элементы вымываются, а выделенная молекула элюируется низко солевым буфером. По сравнению с другими способами этот довольно дорогостоящий, но он позволяет получить большое количество материала, причем очень высокого качества.
Выделение посредством гель-фильтрации
Данный способ дает возможность быстро разделить молекулы в соответствии с их размерами. Используемый гель представляет собой молекулярную сетку, при прохождении через которую биологический материал расщепляется. После этого проводится очищение фенолом или этилом.
Экстракция ионообменной смолой
Образец помещается в пробирку, к нему добавляется ионообменная смола, после чего в течение 30 минут производят инкубацию, а после нее — кипячение и центрифугирование. Это самая недорогая и быстрая процедура, полностью автоматизированная. Но она дает недостаточно хорошую очистку, а молекула, выделенная таким способом, пригодна для исследования в течение определенного промежутка времени, после чего она разрушается.
Спиртовое осаждение нуклеиновых кислот
После осаждения спиртом нуклеиновые кислоты отделяется от раствора центрифугированием. Осадок, содержащий целевую НК, отмывается 70 % этиловым спиртом с последующим центрифугированием. После удаления супернатанта осадок подсушивается и растворяется в водном буфере. Роль соли в протоколе экстракции состоит в том, что её положительно заряженные ионы нейтрализуют отрицательный заряд на сахара-фосфатном скелете НК, приводя к снижению растворимости последних в воде. В водном растворе электростатическое притяжение положительно заряженных ионов и отрицательно заряженных фосфатных групп подчиняется закону Кулона и зависит от диэлектрической константы раствора. Вода имеет большую диэлектрическую константу, что затрудняет взаимодействие ионов, тогда как этанол с гораздо более низкой диэлектрической константой способствует взаимодействию положительно заряженного иона и фосфатной группы, что приводит к выпадению НК в осадок. Нужно отметить, что НК менее растворима в изопропаноле, чем в этаноле, соответственно для ее осаждения требуются меньшая концентрации изопропанола (для выпадения НК в осадок достаточно присутствия 35 % изопропанола и 0,5 М соли, в то время как этанола требуется около 75 % при той же концентрации соли). Таким образом, к образцу изопропанола необходимо добавлять 0,7–1 объема образца, а этанола 2,-2,5 объема. Следовательно, изопропанол предпочтительнее использовать, если есть ограничения по объему используемого пластика (например, есть возможность добавить только один объем образца). В ряде протоколов экстракции предлагается проводить осаждение (преципитацию) НК при пониженной температуре (-20°С). Однако, есть исследователи не согласные с этой теорией; по результатам их экспериментов температура инкубации со спиртом не имеет значительного влияния на выход продукта. Главенствующая роль, по их мнению, должна быть отведена продолжительности центрифугирования.
- Практическая часть
2.1 Провести экстрагирование промышленным набором.
Для проведения натурного эксперимента по выделению ДНК из биологического материала предлагается метод экстрагирования ДНК из живого растительного образца с помощью химического разрушения клеток и спиртового осаждения нуклеиновых кислот.
В качестве исследуемого биологического материала мы взяли растительный образец: почки (глазки) картофеля
Для проведения исследования нам требуется следующее оборудование и материалы:
– пробирка 1.5 мл. — 2 шт.
– Ступа для измельчения
– штатив для пробирок
– пипетка автоматическая
– центрифуга
– термостат
– микроцентрифуга
– вортекс
Химические реагенты:
– бидистиллированная вода
– ЛБ-1(лизирующий буфер 1; содержит NaOH)
– ЛБ-2(лизирующий буфер 2; для нейтрализации pH)
– Проба картофеля (2 образца по 1г)
Продолжительность процесса экстрагирования: около 45 минут.
Порядок и ход исследования / шаги эксперимента:
- Сбор биологического растительного материала (глазки картофеля подготавливаются заранее)
- В 2 пробирки добавили 1 г образца картофеля
- Добавить в пробирку 300 мкл ЛБ-1
- Перемешать на встряхивателе (мешалка типа «Вортекс») в течение 10–15 секунд.
- Поставить в термостат при температуре 95 градусов на 15 минут
- По истечении времени достать пробирки из термостата, поместить их в центрифугу. Центрифугировать 5 секунд для осаждения капель с крышки пробирки.
- Добавить 600 мкл ЛБ-2 в пробирки, не касаясь ее стенок. Перемешать ее содержимое с помощью встряхивателя.
- Центрифугировать в течение 30 секунд при 13000 об./ мин
- ДНК выпадет в виде осадка.
- Осажденную ДНК поместить на предметное стекло для проведения биохимического, молекулярного и микроскопического исследования.
2.2 Провести экстрагирование рутинным методом
В качестве исследуемого биологического материала мы взяли растительный образец: мякоть банана
Для проведения исследования нам требуется следующее оборудование и материалы:
– ступка для растирания
– измерительный стакан -2 штуки
– шпатель
– марля
Химические реагенты:
– Мякоть банана- 50 грамм
– NaCl- 75 грамм
– горячая вода — 100 мл
– охлажденный спирт
– мыло — 30 грамм
Продолжительность процесс: 15 минут
Ход работы:
Приготовим раствор-осадитель:
- К поваренной соли добавляем 30 мл жидкого мыла и 50 мл воды
- Смешать до полного растворения компонентов
Порядок и ход исследования / шаги эксперимента:
- Банан измельчить до однородной массы
- Добавить 50 мл воды
- добавить 5 столовых ложек раствора-осадителя
- Измельчить блендером
- Профильтровать раствор через марлю
- Добавить к фильтрату охлажденный спирт
- При этом выделяется белая волокнистая масса- это белок банана в котором содержится ДНК
Заключение и выводы
Мы рассмотрели значение экстракции ДНК в процессе развития научного знания, охарактеризовали основные методы экстрагирования, узнали о их практическом применении в различных аспектах научных исследований и хозяйственно-экономической деятельности, о применении в народном хозяйстве. Мы также провели эксперимент по практическому извлечению (экстракции) ДНК из растительных образцов одним из методов и закрепили навыки лабораторной работы с биологическими образцами промышленным набором и рутинным методом. Сравнили методы экстрагирования и из полученных результатов опытов, выявили наиболее эффективный и доступный способ экстрагирование.
Литература:
- Chen E. Y., Seeburg P. H. Supercoil sequencing: a fast and simple method for sequencing plasmid DNA //Dna. — 1985. — Т. 4. — №. 2. — С. 165–170.
- Saunders G. C., Rossi J. M. DNA extraction //Essentials of nucleic acid analysis: A robust approach. — 2008. — С. 59–64.
- Alberts B. et al. Integrins //Molecular Biology of the Cell. 4th edition. — Garland Science, 2002.
- Hubscher U. DNA Polymerases: Discovery, Characterization, and Functions in Cellular DNA Transactions. — World Scientific, 2010.
- Steitz T. A. DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms //Journal of Biological Chemistry. — 1999. — Т. 274. — №. 25. — С. 17395–17398.
- Yamtich J., Sweasy J. B. DNA polymerase family X: function, structure, and cellular roles //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. — 2010. — Т. 1804. — №. 5. — С. 1136–1150.
- Kleppe K. et al. Studies on polynucleotides: XCVI. Repair replication of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases //Journal of molecular biology. — 1971. — Т. 56. — №. 2. — С. 341–361
- Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. // Биохимия. — 1980. — T. 45. — C. 644–651.
- Кофиади И. А., Ребриков Д. В. Методы детекции однонуклеотидных полиморфизмов: аллель-специфичная ПЦР и гибридизация с олигонуклеотидной пробой //Генетика. — 2006. — Т. 42. — №. 1. — С. 22–32.
- Прошин И. А., Бурков В. В. Математическое моделирование процессов центрифугирования //Вестник Воронежского государственного технического университета. — 2010. — Т. 6. — №. 11. — С. 71–74.
- Кубрякова Е. С., Лопатин В. В., Улуханов И. С. Словообразование //Большая российская энциклопедия. — 2015. — С. 445–446.
- Gubareva L. V., Kaiser L., Hayden F. G. Influenza virus neuraminidase inhibitors //The Lancet. — 2000. — Т. 355. — №. 9206. — С. 827–835.
