Фотосинтез приводит в движение углеродный цикл на Земле, поддерживая баланс в атмосфере производством кислорода, необходимого для жизни. Он превращает солнечную энергию в органические вещества, питая почти все экосистемы. [1, 2, 3]

Фотосинтез в листьях происходит в пигментах — хлорофиллах и каротиноидах. Хлорофиллы вида a и b — это пигменты, поглощающие красный и синий участки спектра. Они запускают фотосинтез и являются антеннами для поглощения света Их функционирование поддерживается каротиноидами. Растение адаптирует сочетания пигментов к спектру освещающего света. [4,5] Ультрафиолетовый свет поглощается и затем рассеивается хлорофиллом в красной зоне спектра (650–800 нм). [7] Хлорофилл a , хлорофилл b и шесть видов каротиноидов содержатся в специальных клетках хлоропластах.

Чтобы избежать фотохимических разрушений в листе, в нем синтезируются флавоноиды, поглощающие ультрафиолетовое излучение и активируются антиоксиданты уменьшающие риск повреждения УФ излучением ДНК и белков. Подстраивание концентрации пигментов и защитных метаболитов ограждает фотосинтез от разрушения интенсивным солнечным светом. [8, 9, 10]

Переходим к описываемому исследованию

В посёлке Нижний Архыз нами было замечено, что интенсивность флуоресценции листьев крапивы семейства Urtica dioica зависит от интенсивности освещения ультрафиолетовой частью спектра солнечного света. За красную флуоресценцию растений в ультрафиолетовой (УФ)области спектра отвечает хлорофилл, и его содержание в растениях может меняться в зависимости от условий фотосинтеза. Однако в растениях, произрастающих в освещенных местах, флуоресценция почти не наблюдается. У нас возникла гипотеза о том, что в верхней части листа присутствуют вещества, не дающие ультрафиолету проникнуть вглубь листа к хлорофиллу. Проверить это предположение, а также определить, какие именно вещества не пропускают ультрафиолет, стало целью нашего исследования. В процессе была поставлена ещё одна задача — выяснить, как крапива адаптируется к резким изменениям условий освещённости.

Для достижения этих целей выполнялись следующие задачи:

1. Изучить флуоресценцию хлорофилла листьев Крапивы двудомной ( Urtíca dióica ), растущей в нижнем ярусе грабово-букового леса и сравнение с флуоресценцией хлорофилла листьев этого же вида, растущего на освещенной обочине проезжей части рядом с суходольным лугом.
2. Провести хроматографическое разделение пигментов листьев Крапивы двудомной ( Urtica dioica ) растущей в нижнем ярусе грабово-букового леса и на освещенной обочине проезжей части рядом с суходольным лугом.
3. Измерить оптическую плотность и флуоресценции пигментов, экстрагированных из листьев Крапивы двудомной ( Urtica dioica ), взятой из двух исследованных биотопов с помощью спектрофотометра. Изучить различие в показателях.
4. Поменять два изученных растения из разных биотопов местами и посмотреть на динамику изменения флуоресценции хлорофилла.
5. Определить среднюю освещённость мест роста крапив
6. Измерить параметры RGB (параметры цвета пикселей по показателям Red, Blue, Green) на фотографиях листьев из разных условий освещённости
7. Отделить флавоноиды и антоцианы от хлорофилла и получить их спектр

Методы и материалы

Экстракция хлорофилла

Для извлечения экстракта брались листья с 4–5 ярусов считая от верхушки. Листья из теневого биотопа собирались с крапивы из букового леса, листья из светлого биотопа с крапив растущих около кустов вдоль дороги. Для отбора полутеневых листьев измерялся показатель освещенности над растениями, он должен был быть равен 2–4 klux. Брались 5 листьев каждого типа, из каждого листа изготавливался фиксированный объём экстракта, далее исследовался его спектр поглощения.

Для анализа спектров поглощения (оптической плотности) хлорофилла и других пигментов, сначала изготавливали экстракт из листьев крапив. Навеску исследуемых листьев измельчали и перетирали, к ним добавляли фиксированное количество изопропилового спирта и смесь процеживалась. 10 миллилитров получившегося экстракта наливали в кварцевую кювету и проводили анализ на спектрофотометре Vernier Go direct spectrovis plus. У спектрофотометра есть разные режимы, в исследовании измерялась флуоресценция и поглощение (оптическая плотность). Чем выше была оптическая плотность, тем большее количество поглощающих пигментов в образце.

Определение антоцианов

Чтобы определить оптическую плотность антоцианов необходимо было сначала отделить их от хлорофилла таким образом: к 5 мл изопропилового экстракта хлорофилла добавляли 5 мл петролейного эфира, 2 мл чистого изопропанола и 0,5 мл дистиллированной воды. Смесь перемешивали и отстаивали до разделения на два слоя: петролейного эфира с хлорофиллом и водно-спиртовой смеси с антоцианами и другими полярными пигментами. После разделения исследовали спектр поглощения антоцианов спектрофотометрически.

Хроматография

Чтобы получить хроматограммы брались экстракты хлорофилла, их капали на фильтровальную бумагу, её помещали в мерный цилиндр на 100 мл с небольшим количеством уайт спирита на дне. Уайт спирит поднимался вверх по фильтровальной бумаге, осаждая на ней пигменты из капли в порядке уменьшения их полярности. До того как уайт спирит поднялся до конца, бумажка доставалась и сушилась.

Анализ флуоресценции

Характер флуоресценции листьев крапивы определяли, освещая растения УФ-фонариком с длиной волны 365 нм (изготовитель Nichia). Для измерения освещённости использовался телефон с приложением PhyPhox.

Определение характера флуоресценции крапивы

Для определения цветовых параметров флуоресценции, нужные листья фотографировались при освещении УФ излучением в специальном защищенном от дневного света ящике. Фотографии обрабатывали в приложении Inkscape, которое показывало параметры RGB нужных областей. Далее “краснота” флуоресценции определялась по разности яркости канала красного и синего (R-B). ¹⁷ Контролировались спектр УФ облучения, его интенсивность, баланс белого фотокамеры.

Смена условий произрастания дикой крапивы

Чтобы поменять местами образцы крапивы из теневого и из светового биотопа, два растения из разных условий освещённости выкапывались и менялись местами. Каждый вечер делались их фотографии под ультрафиолетом для фиксации изменений в их пигментном составе по флуоресценции.

Разделение биотопов

Для удобства интерпретации и точности результатов мы разделили биотопы на освещенные (нет видимых препятствий для прямых солнечных лучей), полутеневые и темные. Для надежной классификации мы измеряли освещенность биотопов в полдень.

Результаты

Листья крапивы двудомной демонстрируют различный характер флуоресценции в зависимости от биотопа их произрастания. Так, листья крапивы, растущие под прямым солнечным светом практически не светятся красным при освещении верхней плоскости листа. Нижняя часть листа при этом демонстрирует яркую флуоресценцию хлорофилла. Для листьев крапивы из теневых биотопов характерно яркое свечение обоех сторон листа.

1. Связь интенсивности флуоресценции с освещенностью окружающей среды

Измерения освещённости отражены в таблице 1.

Таблица 1

Соотнесение показателя красноты на фотографиях флуоресценции крапив из разных биотопов

В листьях красным в ультрафиолете светится хлорофилл, соответственно, чем более красная флуоресценция, тем больше света принимается хлорофиллом в листе. Показатель R-B (показатель красного) значительно выше у листьев из теневых биотопов, чем из полутеневых и из светлых. Из этого следует, что ультрафиолет лучше попадает на хлорофилл в листьях из теневых биотопов.

2. Исследование пигментного состава экстрактов

Оптическая плотность изопропилового экстракта

По итогам измерений было обнаружено различие в графиках оптической плотности экстрактов крапивы из тени, света и полутени:

Рис. 1. График зависимости оптической плотности от длины волны

Для соотнесения пиков с пигментами, входящими в состав вытяжки мы воспользовались литературными данными. [11, 19]

Таблица 2

Таблица сравнения пиков поглощения различных пигментов

Таблица 3

Таблица значений пиков поглощения экстрактов листьев из разных условий освещённости

Анализ спектров поглощения выявил количественные различия в пигментном составе экстрактов (см. график на рис. 1). У образцов крапивы из теневых биотопов оптическая плотность в диапазоне 620–680 нм (пики хлорофилла) оказалась выше. Согласно количественным данным (таблица 3), содержание хлорофилла в «теневых» листьях на 18 % превышает таковое в листьях с освещенных участков. Это показывает, что увеличение концентрации пигмента в условиях недостатка света выступает одним из механизмов адаптации растения к условиям произрастания. [18]

Отношение оптической плотности экстрактов на длинах волн 430 и 460 нм характеризует количественную разницу между составами экстрактов. На длине волны 430 нм наблюдается пик хлорофилла типа а , а на длине волны 460 нм — пик хлорофилла типа b , кроме того в этом диапазоне наблюдается поглощение каротиноидов. Имеющиеся у нас данные не позволяют однозначно определить причину расхождения в составе экстрактов, однако следуя литературным данным [16] можно ожидать, что в экстракте крапивы, растущей в освещенных биотопах, будет большее количество каротиноидов, чем в теневых биотопах. При этом отношение А430/А460 указывает на то, что веществ, поглощающих в области 460 нм для крапивы из теневых биотопов больше (таблица 3). Это может говорить о несколько большем количестве хлорофилла b в крапиве теневых биотопов.

Более надежные данные можно было бы получить деконволюцией спектров [15] с использованием эталонных спектров поглощения чистых хлорофиллов и каротиноидов, но их у нас не было.

Рис. 2. График зависимости оптической плотности антоцианов от длины волны (различие показано стрелкой)

Анализировался водно-спиртовой раствор, содержащий полярные пигменты из листьев крапив. Для него был получен спектр поглощения. (график на рис. 2).

На этом спектре заметен выраженный пик около 520 нм у образца крапивы из освещённых биотопов. Этот пик обращает на себя внимание из-за того, что он значительно выше, чем у образцов из теневых условий. Поскольку объёмы всех исследуемых растворов были одинаковыми, более высокий пик означает большую концентрацию веществ, поглощающих свет на этой длине волны. Известно, что антоцианы имеют максимум поглощения как раз в области около 520 нм (таблица 2), поэтому наблюдаемое усиление пика, вероятно, связано с их повышенным содержанием. Полученные данные хорошо укладываются в роль антоцианов, которые выполняют фотопротекторную функцию, то есть частично поглощают избыточное излучение и защищают ткани растения от повреждения светом и ультрафиолетом. ¹⁴

Пиков, характерных для флавоноидов, на графике не наблюдается, что ожидаемо: они поглощают в более коротковолновой (ультрафиолетовой) области спектра (таблица 2) и потому не проявляются в данном диапазоне измерений.

Кроме того на графике (рис. 2) остается заметным пик от хлорофилла при 663 нм, что связано с неполным разделением пигментов при обработке петролейным эфиром. К сожалению, коротковолновая область (около 420 нм) плохо поддается интерпретации.

Также была проведена тонкослойная хроматография спиртовых экстрактов листьев из разных условий освещённости.

3. Пересадка крапивы

Рис. 3. Изменение флуоресценции растения пересаженного из света в тень

Таблица 4

Сравнение изменения параметров RGB на фотографиях крапив, пересаженных из света в тень

Рис. 4. Изменение флуоресценции растения пересаженного из тени на свет

Таблица 5

Сравнение изменения параметров RGB на фотографиях крапив, пересаженных из тени на свет

В течение четырёх дней после пересадки растения постепенно меняли характер флуоресценции. У пересаженных в тень растений увеличивается интенсивность красного свечения листьев (то есть флуоресценции хлорофилла) (таблица 4). Это может свидетельствовать об увеличении содержания хлорофилла в листьях, что позволяет растению эффективнее улавливать свет в условиях его недостатка.

У растений, пересаженных на солнце, наблюдается противоположная картина: интенсивность флуоресценции падает (таблица 5). Из этого можно продпоожить, что они адаптируются к избытку света, увеличивая содержание антоцианов и снижая содержание хлорофилла. Такие изменения направлены на защиту от избыточного ультрафиолетового излучения. Полученные результаты показывают, что концентрация пигментов не является жёстко фиксированной наследственной характеристикой, а может быстро изменяться, выступая в роли адаптационного механизма.

Выводы

По собранным данным можно сделать вывод, что крапива демонстрирует разную интенсивность флуоресценции в зависимости от освещенности места произрастания. Чем интенсивнее освещенность, тем слабее флуоресценция листьев и наоборот. Это связано с разным качественным и количественным пигментным составом листьев. Снижение интенсивности флуоресценции связано с пониженной концентрацией хлорофилла и повышенной концентрацией антоцианов, что подтверждается графиками оптической плотности .

Изменение концентрации пигментов является адаптационным механизмом, защищающим крапиву от интенсивного ультрафиолета в прямых солнечных лучах. Крапива довольно быстро реагирует на смену внешних условий. Результаты наблюдения за пересаженными растениями крапивы показали, что они могут полностью поменять интенсивность флуоресценции за 4 дня благодаря адаптации к новым условиям.

Литература:

1. Stirbet, A., Photosynthesis: basics, history and modelling, PMC, 2019.
2. Gondim, E., The Crucial Role of Photosynthesis in Sustaining Plant Life, Australian Herbal Insight, 2020.
3. Flügge, U.I., Recent advances in understanding photosynthesis, PMC, 2016.
4. Petibon, F. et al., Characterization of complex photosynthetic pigment derivatives, PMC, 2022.
5. Wiley Online Library, Internal and external factors affecting photosynthetic pigment contents.
6. Shoji, S., et al., Plant growth acceleration using a transparent Eu 3+, Scientific Reports, 2022, describing strong red luminescence in plants under UV irradiation due to chlorophyll fluorescence.
7. Shi, C. et al., How plants protect themselves from ultraviolet-B radiation, PMC, 2021.
8. Max Planck Institute, Sun protection for plants.
9. PMC, Ultraviolet Radiation From a Plant Perspective, 2020.
10. Wang, X., et al., Effect of UV-B radiation on chlorophyll fluorescence, photosynthetic performance, and flavonoid synthesis in corn, ScienceDirect, 2022.
11. Ashenafi, Eyosias L., Marianne C. Nyman, Jacob T. Shelley, and Neil S. Mattson. Spectral Properties and Stability of Selected Carotenoid and Chlorophyll Compounds in Different Solvent Systems. Food Chemistry Advances 2, 2023.
12. Koli, Pooran. Characterization, Stability, and Feasibility of Long-Term Use of Light-Absorbing Components of Aqueous Spinach Extract-Based Photogalvanic Electrolyte. Scientific Reports 12, no. 1, 2022.
13. Nunes, Alesandra R., Ícaro G. P. Vieira, Dinalva B. Queiroz, Antonio Linkoln Alves Borges Leal, Selene Maia Morais, Débora Feitosa Muniz, João Tavares Calixto-Junior, and Henrique Douglas Melo Coutinho. Use of Flavonoids and Cinnamates, the Main Photoprotectors with Natural Origin. Advances in Pharmacological Sciences 2018
14. Gould, Kevin S. Nature’s Swiss Army Knife: The Diverse Protective Roles of Anthocyanins in Leaves. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2004, no. 5 (December 1, 2004): 314–20. https://doi.org/10.1155/s1110724304406147 .
15. Chazaux, Marie, Christo Schiphorst, Gioele Lazzari, and Stefano Caffarri. Precise Estimation of Chlorophyll A, B and Carotenoid Content by Deconvolution of the Absorption Spectrum and New Simultaneous Equations for Chl Determination. The Plant Journal, January 3, 2022. https://doi.org/10.1111/tpj.15643 .
16. Маслова, Т. Г., Е. Ф. Марковская, and Н. Н. Слемнев. Функции каротиноидов в листьях высших растений (обзор). Журнал общей биологии 81, no. 4 (2020): 297–310. https://doi.org/10.31857/s0044459620040065 .
17. lco.global. Magnitude and Color, n.d. https://lco.global/spacebook/distance/magnitude-and-color/ .
18. Ivanov, L. A., D. A. Ronzhina, P. K. Udina, N. V. Zolotareva, I. V. Ivanova, and L. A. Kalashnikova. Физиология растений. T. 67, Номер 3, 2020. Sciencejournals.ru, 2020. https://sciencejournals.ru/view-article/?j=fizrast&y=2020&v=67&n=3&a=FizRast2003011Ivanov#R5
19. Peters, Reisha D., and Scott D. Noble. Spectrographic Measurement of Plant Pigments from 300 to 800nm. Remote Sensing of Environment 148 (May 25, 2014): 119–23. https://doi.org/10.1016/j.rse.2014.03.020.
20. Dong, Wen, Xin Yang, Ning Zhang, Pei Chen, Jianghao Sun, James M. Harnly, and Mengliang Zhang. Study of UV–Vis Molar Absorptivity Variation and Quantitation of Anthocyanins Using Molar Relative Response Factor. Food Chemistry 444 (June 2024): 138653. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.138653.